304 spolrör av rostfritt stål kemisk komponent, Strukturen av SPACA6-ektodomänen innehåller en bevarad superfamilj av proteiner associerade med könscellsfusion.

Tack för att du besöker Nature.com.Du använder en webbläsarversion med begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Dessutom, för att säkerställa löpande support, visar vi webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Reglage som visar tre artiklar per bild.Använd bakåt- och nästaknapparna för att flytta genom bilderna, eller skjutkontrollknapparna i slutet för att flytta genom varje bild.

SPACA6 är ett spermieuttryckt ytprotein som är avgörande för könscellers fusion under däggdjurs sexuella reproduktion.Trots denna grundläggande roll är den specifika funktionen av SPACA6 dåligt förstådd.Vi belyser kristallstrukturen för den extracellulära domänen av SPACA6 vid en upplösning av 2,2 Å, och avslöjar ett tvådomänsprotein som består av en fyrsträngad bunt och Ig-liknande β-smörgåsar sammanfogade av kvasiflexibla linkers.Denna struktur liknar IZUMO1, ett annat gametfusionsassocierat protein, vilket gör SPACA6 och IZUMO1 till grundande medlemmar av superfamiljen av befruktningsassocierade proteiner som här hänvisas till som IST-superfamiljen.IST-superfamiljen definieras strukturellt av dess tvinnade fyra-helixbunt och ett par disulfidkopplade CXXC-motiv.En strukturbaserad AlphaFold-sökning av det mänskliga proteomet identifierade ytterligare proteinmedlemmar i denna superfamilj;i synnerhet är många av dessa proteiner involverade i gametfusion.SPACA6-strukturen och dess relation till andra medlemmar av IST-superfamiljen ger den felande länken i vår kunskap om fusion av däggdjurs gameter.
Varje mänskligt liv börjar med två separata haploida könsceller: faderns sperma och moderns ägg.Denna spermie är vinnaren av en intensiv urvalsprocess under vilken miljontals spermieceller passerar genom det kvinnliga könsorganet, övervinner olika hinder1 och genomgår kapacitering, vilket förbättrar deras rörlighet och processen med ytkomponenter2,3,4.Även om spermierna och oocyten hittar varandra är processen inte över än.Oocyten är omgiven av ett lager av cumulusceller och en glykoproteinbarriär som kallas zona pellucida, genom vilken spermier måste passera för att komma in i oocyten.Spermatozoer använder en kombination av ytadhesionsmolekyler och membranassocierade och utsöndrade enzymer för att övervinna dessa slutliga barriärer5.Dessa molekyler och enzymer lagras huvudsakligen i det inre membranet och den akrosomala matrisen och detekteras när spermiernas yttre membran lyseras under den akrosomala reaktionen6.Det sista steget i denna intensiva resa är fusionshändelsen spermie-ägg, där de två cellerna smälter samman sina membran till en enda diploid organism7.Även om denna process är banbrytande i mänsklig reproduktion, är de nödvändiga molekylära interaktionerna dåligt förstådda.
Förutom befruktning av könsceller har kemin för fusionen av två lipiddubbelskikt studerats omfattande.I allmänhet är membranfusion en energiskt ogynnsam process som kräver att en proteinkatalysator genomgår en strukturell konformationsförändring som för två membran närmare varandra, bryter deras kontinuitet och orsakar fusion8,9.Dessa proteinkatalysatorer är kända som fusogener och har hittats i otaliga fusionssystem.De krävs för viralt inträde i värdceller (t.ex. gp160 i HIV-1, spik i coronavirus, hemagglutinin i influensavirus)10,11,12 placenta (syncytin)13,14,15 och gametbildande fusioner i lägre eukaryoter ( HAP2/GCS1 i växter, protister och leddjur) 16,17,18,19.Fusogener för mänskliga könsceller har ännu inte upptäckts, även om flera proteiner har visat sig vara kritiska för könsceller vidfästning och fusion.Den oocytuttryckta CD9, ett transmembranprotein som krävs för sammansmältning av mus- och mänskliga könsceller, var den första som upptäcktes 21,22,23.Även om dess exakta funktion förblir oklar, verkar en roll i vidhäftning, strukturen av vidhäftningsfoci på äggmikrovilli och/eller den korrekta lokaliseringen av oocytytproteiner sannolikt 24,25,26.De två mest typiska proteinerna som är kritiska för gametfusion är spermieproteinet IZUMO127 och oocytproteinet JUNO28, och deras ömsesidiga association är ett viktigt steg i gameterigenkänning och adhesion före fusion.Izumo1 knockoutmöss av hankön och Juno knockoutmöss av honkön är helt sterila, i dessa modeller kommer spermier in i perivitellina utrymmet men gameter smälter inte samman.På liknande sätt reducerades konfluensen när könsceller behandlades med anti-IZUMO1- eller JUNO27,29-antikroppar i humana in vitro-fertiliseringsexperiment.
Nyligen har en nyupptäckt grupp av spermieuttryckta proteiner som fenotypiskt liknar IZUMO1 och JUNO20,30,31,32,33,34,35 upptäckts.Sperma akrosomalt membranassocierat protein 6 (SPACA6) har identifierats som väsentligt för befruktning i en storskalig murin mutagenesstudie.Införande av transgenen i Spaca6-genen producerar icke smältbara spermier, även om dessa spermier infiltrerar det perivitellina utrymmet 36 .Efterföljande knockoutstudier på möss bekräftade att Spaca6 krävs för gametfusion 30,32.SPACA6 uttrycks nästan uteslutande i testiklarna och har ett lokaliseringsmönster som liknar det för IZUMO1, nämligen inom intima av spermatozoerna före den akrosomala reaktionen, och migrerar sedan till ekvatorialområdet efter den akrosomala reaktionen 30,32.Spaca6-homologer finns i en mängd olika däggdjur och andra eukaryoter 30 och dess betydelse för human könscellsfusion har visats genom hämning av mänsklig befruktning in vitro genom resistens mot SPACA6 30 .Till skillnad från IZUMO1 och JUNO förblir detaljerna i strukturen, interaktionerna och funktionen hos SPACA6 oklara.
För att bättre förstå den grundläggande processen som ligger bakom sammansmältningen av mänskliga spermier och ägg, vilket kommer att göra det möjligt för oss att informera om framtida utvecklingar inom familjeplanering och fertilitetsbehandling, genomförde vi SPACA6 strukturella och biokemiska studier.Kristallstrukturen för den extracellulära domänen av SPACA6 visar en fyrspiralformad bunt (4HB) och en immunglobulinliknande (Ig-liknande) domän sammankopplade av kvasiflexibla regioner.Som förutspåtts i tidigare studier, 7,32,37 liknar domänstrukturen för SPACA6 den för human IZUMO1, och de två proteinerna delar ett ovanligt motiv: 4HB med en triangulär spiralformad yta och ett par disulfidkopplade CXXC-motiv.Vi föreslår att IZUMO1 och SPACA6 nu definierar en större, strukturellt besläktad superfamilj av proteiner associerade med gametfusion.Med hjälp av funktioner som är unika för superfamiljen genomförde vi en uttömmande sökning efter det strukturella mänskliga proteomet AlphaFold, och identifierade ytterligare medlemmar av denna superfamilj, inklusive flera medlemmar som är involverade i gametfusion och/eller befruktning.Det verkar nu som att det finns en gemensam strukturell veckning och superfamilj av proteiner associerade med gametfusion, och vår struktur ger en molekylär karta över denna viktiga aspekt av den mänskliga gametfusionsmekanismen.
SPACA6 är ett enkelpassage transmembranprotein med en N-kopplad glykan och sex förmodade disulfidbindningar (figurerna S1a och S2).Vi uttryckte den extracellulära domänen av human SPACA6 (rester 27-246) i Drosophila S2-celler och renade proteinet med nickelaffinitet, katjonbyte och storleksuteslutningskromatografi (Fig. S1b).Den renade SPACA6-ektodomänen är mycket stabil och homogen.Analys med hjälp av storleksuteslutningskromatografi kombinerat med polygonal ljusspridning (SEC-MALS) visade en topp med en beräknad molekylvikt på 26,2 ± 0,5 kDa (Fig. S1c).Detta överensstämmer med storleken på den monomera ektodomänen SPACA6, vilket indikerar att oligomerisering inte inträffade under rening.Dessutom avslöjade cirkulär dikroism (CD) spektroskopi en blandad α/β-struktur med en smältpunkt på 51,3 °C (Fig. S1d,e).Dekonvolution av CD-spektra avslöjade 38,6% α-helix och 15,8% β-strängade element (Figur S1d).
SPACA6-ektodomänen kristalliserades med användning av slumpmässig matrissådd38, vilket resulterade i en datauppsättning med en upplösning på 2,2 Å (tabell 1 och figur S3).Med hjälp av en kombination av fragmentbaserad molekylär substitution och SAD-fasningsdata med bromidexponering för strukturbestämning (tabell 1 och figur S4), består den slutliga raffinerade modellen av resterna 27–246.När strukturen bestämdes fanns det inga experimentella eller AlphaFold-strukturer tillgängliga.SPACA6-ektodomänen mäter 20 Å × 20 Å × 85 Å, består av sju helixar och nio β-strängar och har en långsträckt tertiär veck stabiliserad av sex disulfidbindningar (Fig. 1a, b).Den svaga elektrontätheten i slutet av Asn243-sidokedjan indikerar att denna rest är en N-länkad glykosylering.Strukturen består av två domäner: en N-terminal fyrhelixbunt (4HB) och en C-terminal Ig-liknande domän med en mellanliggande gångjärnsregion mellan dem (Fig. 1c).
a Struktur av den extracellulära domänen av SPACA6.Remsdiagram av den extracellulära domänen av SPACA6, färgen på kedjan från N till C-terminalen från mörkblå till mörkröd.Cysteiner involverade i disulfidbindningar är markerade i magenta.b Topologi för den extracellulära domänen av SPACA6.Använd samma färgschema som i figur 1a.c SPACA6 extracellulär domän.4HB-, gångjärns- och Ig-liknande domänremsor är färgade orange, grönt respektive blått.Skikten är inte skalenliga.
4HB-domänen i SPACA6 inkluderar fyra huvudspiraler (helixar 1–4), som är arrangerade i form av en spiralformad helix (Fig. 2a), alternerande mellan antiparallella och parallella interaktioner (Fig. 2b).En liten extra enkelvarvsspiral (helix 1′) läggs vinkelrätt mot bunten och bildar en triangel med spiralerna 1 och 2. Denna triangel är något deformerad i den spiralformade packningen av den relativt täta packningen av spiralerna 3 och 4 ( Fig. 2a).
4HB N-terminal listdiagram.b Ovanifrån av ett knippe med fyra spiraler, varje spiral markerad i mörkblått vid N-änden och mörkröd vid C-änden.c Top-down spiralhjuldiagram för 4HB, med varje rest visad som en cirkel märkt med en enbokstavs aminosyrakod;endast de fyra aminosyrorna längst upp på hjulet är numrerade.Icke-polära rester färgas gula, polära oladdade rester färgas gröna, positivt laddade rester färgas blå och negativt laddade rester färgas röda.d Triangulära ytor av 4HB-domänen, med 4HBs i orange och gångjärn i grönt.Båda insättningarna visar stavformade disulfidbindningar.
4HB är koncentrerad på en inre hydrofob kärna som huvudsakligen består av alifatiska och aromatiska rester (fig. 2c).Kärnan innehåller en disulfidbindning mellan Cys41 och Cys55 som länkar samman helixarna 1 och 2 i en övre upphöjd triangel (Fig. 2d).Två ytterligare disulfidbindningar bildades mellan CXXC-motivet i Helix 1′ och ett annat CXXC-motiv som hittades vid spetsen av β-hårnålen i gångjärnsregionen (Fig. 2d).En konservativ argininrest med en okänd funktion (Arg37) finns inuti en ihålig triangel som bildas av spiralerna 1', 1 och 2. Alifatiska kolatomer Cβ, Cγ och Cδ Arg37 interagerar med den hydrofoba kärnan, och dess guanidingrupper rör sig cykliskt mellan spiralerna 1' och 1 via interaktioner mellan Thr32-ryggraden och sidokedjan (Fig. S5a, b).Tyr34 sträcker sig in i kaviteten och lämnar två små kaviteter genom vilka Arg37 kan interagera med lösningsmedlet.
Ig-liknande β-sandwichdomäner är en stor superfamilj av proteiner som delar den gemensamma egenskapen hos två eller flera flersträngade amfipatiska β-ark som interagerar via en hydrofob kärna 39. Den C-terminala Ig-liknande domänen av SPACA6 har samma mönster och består av två lager (Fig. S6a).Ark 1 är ett β-ark med fyra strängar (strängarna D, F, H och I) där strängarna F, H och I bildar ett antiparallellt arrangemang och strängarna I och D antar en parallell interaktion.Tabell 2 är ett litet antiparallellt dubbelsträngat beta-ark (strängarna E och G).En intern disulfidbindning observerades mellan C-terminalen av E-kedjan och mitten av H-kedjan (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Denna disulfidbindning är analog med disulfidbindningen i β-sandwichdomänen av immunglobulin40,41.
Det fyrsträngade β-arket vrider sig längs hela sin längd och bildar asymmetriska kanter som skiljer sig åt i form och elektrostatik.Den tunnare kanten är en platt hydrofob miljöyta som sticker ut jämfört med de återstående ojämna och elektrostatiskt olika ytorna i SPACA6 (Fig. S6b,c).En halo av exponerade ryggradskarbonyl/aminogrupper och polära sidokedjor omger den hydrofoba ytan (Fig. S6c).Den bredare marginalen täcks av ett täckt spiralsegment som blockerar den N-terminala delen av den hydrofoba kärnan och bildar tre vätebindningar med den öppna polära gruppen i F-kedjans ryggrad (Fig. S6d).Den C-terminala delen av denna kant bildar en stor ficka med en delvis exponerad hydrofob kärna.Fickan är omgiven av positiva laddningar på grund av tre uppsättningar av dubbla argininrester (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 och Arg212-Arg214) och en central histidin (His220) (Figur S6e).
Gångjärnsregionen är ett kort segment mellan den spiralformade domänen och den Ig-liknande domänen, bestående av ett antiparallellt tresträngat β-lager (strängarna A, B och C), en liten 310 helix och flera långa slumpmässiga spiralsegment.(Fig. S7).Ett nätverk av kovalenta och elektrostatiska kontakter i gångjärnsregionen verkar stabilisera orienteringen mellan 4HB och den Ig-liknande domänen.Nätverket kan delas upp i tre delar.Den första delen innehåller två CXXC-motiv (27CXXC30 och 139CXXC142) som bildar ett par disulfidbindningar mellan β-hårnålen i gångjärnet och 1′ helixen i 4HB.Den andra delen inkluderar elektrostatiska interaktioner mellan den Ig-liknande domänen och gångjärnet.Glu132 i gångjärnet bildar en saltbrygga med Arg233 i den Ig-liknande domänen och Arg135 i gångjärnet.Den tredje delen inkluderar en kovalent bindning mellan den Ig-liknande domänen och gångjärnsregionen.Två disulfidbindningar (Cys124-Cys147 och Cys128-Cys153) ansluter gångjärnsslingan till en länk som stabiliseras av elektrostatiska interaktioner mellan Gln131 och den funktionella ryggradsgruppen, vilket ger tillgång till den första Ig-liknande domänen.kedja.
Strukturen för SPACA6-ektodomänen och individuella strukturer av 4HB- och Ig-liknande domäner användes för att söka efter strukturellt liknande poster i proteindatabaser 42 .Vi identifierade matchningar med höga Dali Z-poäng, små standardavvikelser och stora LALI-poäng (det senare är antalet strukturellt ekvivalenta rester).Medan de första 10 träffarna från den fullständiga ektodomänsökningen (tabell S1) hade en acceptabel Z-poäng på >842, visade en sökning efter 4HB eller Ig-liknande domän enbart att de flesta av dessa träffar endast motsvarade β-smörgåsar.en allestädes närvarande veck som finns i många proteiner.Alla tre sökningar i Dali gav bara ett resultat: IZUMO1.
Det har länge föreslagits att SPACA6 och IZUMO1 delar strukturella likheter7,32,37.Även om ektodomänerna för dessa två gametfusionsassocierade proteiner bara delar 21 % sekvensidentitet (Figur S8a), möjliggjorde komplexa bevis, inklusive ett konserverat disulfidbindningsmönster och en förutspådd C-terminal Ig-liknande domän i SPACA6, tidiga försök att bygga en homologimodell av A en SPACA6-mus som använder IZUMO1 som mall37.Vår struktur bekräftar dessa förutsägelser och visar den sanna graden av likhet.Faktum är att SPACA6- och IZUMO137,43,44-strukturerna delar samma tvådomänarkitektur (Fig. S8b) med liknande 4HB- och Ig-liknande β-sandwichdomäner anslutna av en gångjärnsregion (Fig. S8c).
IZUMO1 och SPACA6 4HB har gemensamma skillnader från konventionella spiralbuntar.Typiska 4HBs, som de som finns i SNARE-proteinkomplex involverade i endosomal fusion 45,46, har jämnt fördelade helixar som upprätthåller en konstant krökning runt en central axel 47. Däremot var de spiralformade domänerna i både IZUMO1 och SPACA6 förvrängda, med variabel krökning och ojämn packning (Figur S8d).Vridningen, troligen orsakad av triangeln som bildas av spiralerna 1′, 1 och 2, behålls i IZUMO1 och SPACA6 och stabiliseras av samma CXXC-motiv på helix 1′.Den ytterligare disulfidbindningen som finns i SPACA6 (Cys41 och Cys55 som kovalent länkar spiral 1 och 2 ovan) skapar en skarpare spets vid triangelns spets, vilket gör SPACA6 mer vriden än IZUMO1, med mer uttalade kavitetstrianglar.Dessutom saknar IZUMO1 Arg37 som observerats i mitten av denna hålighet i SPACA6.Däremot har IZUMO1 en mer typisk hydrofob kärna av alifatiska och aromatiska rester.
IZUMO1 har en Ig-liknande domän som består av ett dubbelsträngat och femsträngat β-ark43.Den extra strängen i IZUMO1 ersätter spolen i SPACA6, som interagerar med F-strängen för att begränsa vätebindningar i ryggraden i strängen.En intressant jämförelsepunkt är den förutsagda ytladdningen för de Ig-liknande domänerna av de två proteinerna.IZUMO1-ytan är mer negativt laddad än SPACA6-ytan.En extra laddning är placerad nära C-terminalen som är vänd mot spermiemembranet.I SPACA6 var samma regioner mer neutrala eller positivt laddade (Fig. S8e).Till exempel är den hydrofoba ytan (tunnare kanter) och positivt laddade gropar (bredare kanter) i SPACA6 negativt laddade i IZUMO1.
Även om förhållandet och sekundära strukturelement mellan IZUMO1 och SPACA6 är välbevarade, visade den strukturella anpassningen av de Ig-liknande domänerna att de två domänerna skiljer sig i sin allmänna orientering i förhållande till varandra (Fig. S9).Spiralknippet av IZUMO1 är krökt kring β-smörgåsen, vilket skapar den tidigare beskrivna "boomerangen"-formen ca 50° från den centrala axeln.Däremot lutades den spiralformade strålen i SPACA6 ca 10° i motsatt riktning.Skillnaderna i dessa orienteringar beror sannolikt på skillnader i gångjärnsregionen.På den primära sekvensnivån delar IZUMO1 och SPACA6 liten sekvenslikhet vid gångjärnet, med undantag för cystein-, glycin- och asparaginsyrarester.Som ett resultat är vätebindningar och elektrostatiska nätverk helt olika.β-arks sekundära strukturelement delas av IZUMO1 och SPACA6, även om kedjorna i IZUMO1 är mycket längre och 310 helix (helix 5) är unik för SPACA6.Dessa skillnader resulterar i olika domänorienteringar för två annars liknande proteiner.
Vår Dali-serversökning avslöjade att SPACA6 och IZUMO1 är de enda två experimentellt bestämda strukturerna lagrade i proteindatabasen som har denna speciella 4HB-fald (tabell S1).På senare tid har DeepMind (Alphabet/Google) utvecklat AlphaFold, ett neuralt nätverksbaserat system som exakt kan förutsäga 3D-strukturer av proteiner från primära sekvenser48.Kort efter att vi löst SPACA6-strukturen släpptes AlphaFold-databasen, som tillhandahåller prediktiva strukturmodeller som täcker 98,5 % av alla proteiner i det mänskliga proteomet48,49.Med hjälp av vår upplösta SPACA6-struktur som en sökmodell identifierade en strukturell homologisökning efter modellen i det mänskliga AlphaFold-proteomet kandidater med möjliga strukturella likheter med SPACA6 och IZUMO1.Med tanke på AlphaFolds otroliga noggrannhet när det gäller att förutsäga SPACA6 (Fig. S10a) – särskilt 1,1 Å rms ektodomän jämfört med vår upplösta struktur (Fig. S10b) – kan vi vara säkra på att de identifierade SPACA6-matchningarna sannolikt är korrekta.
Tidigare sökte PSI-BLAST efter IZUMO1-klustret med tre andra spermieassocierade proteiner: IZUMO2, IZUMO3 och IZUMO450.AlphaFold förutspådde att dessa IZUMO-familjeproteiner viker sig in i 4HB-domänen med samma disulfidbindningsmönster som IZUMO1 (figur 3a och S11), även om de saknar en Ig-liknande domän.Det antas att IZUMO2 och IZUMO3 är ensidiga membranproteiner som liknar IZUMO1, medan IZUMO4 verkar utsöndras.Funktionerna av IZUMO 2, 3 och 4 proteiner i gametfusion har inte fastställts.IZUMO3 är känt för att spela en roll i akrosombiogenes under spermieutveckling51 och IZUMO-proteinet har visat sig bilda ett komplex50.Konserveringen av IZUMO-proteiner i däggdjur, reptiler och amfibier tyder på att deras potentiella funktion överensstämmer med den hos andra kända gametfusionsassocierade proteiner, såsom DCST1/2, SOF1 och FIMP.
Diagram över domänarkitekturen för IST-superfamiljen, med 4HB, gångjärn och Ig-liknande domäner markerade i orange, grönt respektive blått.IZUMO4 har en unik C-terminal region som ser svart ut.Bekräftade och förmodade disulfidbindningar visas med heldragna respektive prickade linjer.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1), (AlphaFold TMEM95), DB: AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q1ZYL8-F1): AF-Q3KNT9-F1) visas i samma färgområde som panel A. Disulfidbindningar visas i magenta.TMEM95, IZUMO2 och IZUMO3 transmembranspiraler visas inte.
Till skillnad från IZUMO-proteinet tros andra SPACA-proteiner (dvs SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 och SPACA9) vara strukturellt annorlunda än SPACA6 (Fig. S12).Endast SPACA9 har 4HB, men det förväntas inte ha samma parallell-anti-parallella orientering eller samma disulfidbindning som SPACA6.Endast SPACA1 har en liknande Ig-liknande domän.AlphaFold förutspår att SPACA3, SPACA4 och SPACA5 har en helt annan struktur än SPACA6.Intressant nog är SPACA4 också känt för att spela en roll vid befruktning, men i större utsträckning än SPACA6, vilket istället underlättar interaktionen mellan spermier och oocyt zona pellucida52.
Vår AlphaFold-sökning hittade en annan matchning för IZUMO1 och SPACA6 4HB, TMEM95.TMEM95, ett enda spermiespecifikt transmembranprotein, gör hanmöss infertila när de tas bort 32,33.Spermatozoer som saknade TMEM95 hade normal morfologi, motilitet och förmåga att penetrera zona pellucida och binda till äggmembranet, men kunde inte smälta samman med oocytmembranet.Tidigare studier har visat att TMEM95 delar strukturella likheter med IZUMO133.Faktum är att AlphaFold-modellen bekräftade att TMEM95 är en 4HB med samma par av CXXC-motiv som IZUMO1 och SPACA6 och samma ytterligare disulfidbindning mellan spiralerna 1 och 2 som finns i SPACA6 (Fig. 3a och S11).Även om TMEM95 saknar en Ig-liknande domän, har den en region med ett disulfidbindningsmönster som liknar SPACA6 och IZUMO1 gångjärnsregionerna (Fig. 3b).Vid tidpunkten för publiceringen av detta manuskript rapporterade preprint-servern strukturen för TMEM95, vilket bekräftar AlphaFold53-resultatet.TMEM95 är mycket lik SPACA6 och IZUMO1 och är evolutionärt bevarad redan i amfibier (Fig. 4 och S13).
PSI-BLAST-sökningen använde databaserna NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP och SOF1 för att bestämma positionen för dessa sekvenser i livets träd.Avstånd mellan grenpunkter visas inte skalenligt.
Den slående övergripande strukturella likheten mellan SPACA6 och IZUMO1 tyder på att de är grundande medlemmar av en konserverad strukturell superfamilj som inkluderar TMEM95 och IZUMO 2, 3 och 4 proteiner.kända medlemmar: IZUMO1, SPACA6 och TMEM95.Eftersom endast ett fåtal medlemmar har Ig-liknande domäner, är kännetecknet för IST-superfamiljen 4HB-domänen, som har unika egenskaper som är gemensamma för alla dessa proteiner: 1) Coiled 4HB med helixar arrangerade i en anti-parallell/parallell alternering (Fig. . 5a), 2) bunten har en triangulär yta som består av två spiraler i bunten och en tredje vertikal helix (fig. nyckelområde (fig. 5c). CXXC-motivet, som finns i tioredoxinliknande proteiner, är känt för att fungera som en redoxsensor 54,55,56, medan motivet i IST-familjemedlemmar kan associeras med proteindisulfid-isomeraser såsom ERp57 i gametfusion.Roller är associerade 57,58.
Medlemmar av IST-superfamiljen definieras av tre karakteristiska egenskaper hos 4HB-domänen: fyra helixar som växlar mellan parallell och antiparallell orientering, ba-triangulära spiralformade buntsytor och ett ca CXXC dubbelt motiv bildat mellan små molekyler.) N-terminala helixar (orange) och gångjärnsregionens β-hårnål (grön).
Med tanke på likheten mellan SPACA6 och IZUMO1 testades förmågan hos den förra att binda till IZUMO1 eller JUNO.Biolagerinterferometri (BLI) är en kinetisk-baserad bindningsmetod som tidigare har använts för att kvantifiera interaktionen mellan IZUMO1 och JUNO.Efter inkubation av den biotinmärkta sensorn med IZUMO1 som ett bete med en hög koncentration av JUNO-analyt detekterades en stark signal (Fig. S14a), vilket indikerar en bindningsinducerad förändring i tjockleken på biomaterialet fäst vid sensorspetsen.Liknande signaler (dvs JUNO kopplad till sensorn som ett bete mot IZUMO1 analyt) (Fig. S14b).Ingen signal upptäcktes när SPACA6 användes som en analyt mot sensorbunden IZUMO1 eller sensorbunden JUNO (Figur S14a,b).Frånvaron av denna signal indikerar att den extracellulära domänen av SPACA6 inte interagerar med den extracellulära domänen av IZUMO1 eller JUNO.
Eftersom BLI-analysen är baserad på biotinylering av fria lysinrester på betesproteinet, kan denna modifiering förhindra bindning om lysinrester är involverade i interaktionen.Dessutom kan orienteringen av bindningen i förhållande till sensorn skapa steriska hinder, så konventionella neddragningsanalyser utfördes också på de rekombinanta ektodomänerna SPACA6, IZUMO1 och JUNO.Trots detta fälldes inte SPACA6 ut med His-märkt IZUMO1 eller His-märkt JUNO (Fig. S14c, d), vilket tyder på att ingen interaktion överensstämmer med den som observerats i BLI-experiment.Som en positiv kontroll bekräftade vi interaktionen av JUNO med märkt His IZUMO1 (figurerna S14e och S15).
Trots den strukturella likheten mellan SPACA6 och IZUMO1 är oförmågan hos SPACA6 att binda JUNO inte förvånande.Ytan av human IZUMO1 har mer än 20 rester som interagerar med JUNO, inklusive rester från var och en av de tre regionerna (även om de flesta av dem är belägna i gångjärnsregionen) (Fig. S14f).Av dessa rester är endast en konserverad i SPACA6 (Glu70).Medan många restsubstitutioner behöll sina ursprungliga biokemiska egenskaper, ersattes den väsentliga Arg160-resten i IZUMO1 av den negativt laddade Asp148 i SPACA6;Tidigare studier har visat att Arg160Glu-mutationen i IZUMO1 nästan helt upphäver bindningen till JUNO43.Dessutom ökade skillnaden i domänorientering mellan IZUMO1 och SPACA6 signifikant ytarean av JUNO-bindningsstället för motsvarande region på SPACA6 (Fig. S14g).
Trots det kända behovet av SPACA6 för gametfusion och dess likhet med IZUMO1, verkar SPACA6 inte ha en likvärdig JUNO-bindande funktion.Därför har vi försökt kombinera våra strukturella data med bevis av betydelse från evolutionär biologi.Sekvensanpassning av SPACA6-homologer visar bevarandet av den gemensamma strukturen bortom däggdjur.Till exempel finns cysteinrester även i avlägset besläktade amfibier (Fig. 6a).Med hjälp av ConSurf-servern kartlades flera sekvensanpassningsretentionsdata för 66 sekvenser till SPACA6-ytan.Denna typ av analys kan visa vilka rester som har bevarats under proteinutvecklingen och kan indikera vilka ytregioner som spelar en roll i funktionen.
en sekvensanpassning av SPACA6 ektodomäner från 12 olika arter framställda med CLUSTAL OMEGA.Enligt ConSurf-analysen är de mest konservativa positionerna markerade med blått.Cysteinrester är markerade i rött.Domängränser och sekundära strukturelement visas högst upp i linjeringen, där pilar indikerar β-strängar och vågor indikerar helixer.NCBI Access Identifiers som innehåller sekvenserna är: människa (Homo sapiens, NP_001303901), mandrill (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), capuchin apa (Cebus mimic, XP_017359366), häst (Equus caballus5 killer, XP6_1023 mördare, XP6_023, XP6_023) 032_034).), får (Ovis aries, XP_014955560), elefant (Loxodonta africana, XP_010585293), hund (Canis lupus familyis, XP_025277208), mus (Mus musculus, NP_001156381), Tasmanian devil, XPiSarcophilus_1, XPi31, XPi31, XPi31, XP31, XP31 ), Platypus, 8) , 61_89 och Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Numreringen är baserad på mänsklig ordning.b Ytrepresentation av SPACA6-strukturen med 4HB överst och Ig-liknande domän längst ned, färger baserade på bevarandeuppskattningar från ConSurf-servern.De bäst bevarade delarna är i blått, de måttligt bevarade delarna är i vitt och de minst bevarade är i gult.lila cystein.Tre ytlappar som visar en hög skyddsnivå visas i de infällda märkta lapparna 1, 2 och 3. En 4HB-tecknad serie visas i insättningen uppe till höger (samma färgschema).
SPACA6-strukturen har tre mycket konserverade ytregioner (fig. 6b).Patch 1 spänner över 4HB och gångjärnsregionen och innehåller två konserverade CXXC disulfidbryggor, ett Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 gångjärnsnätverk (Fig. S7) och tre konserverade yttre aromatiska rester (Phe31, Tyr73, Phe137)).en bredare kant av den Ig-liknande domänen (Fig. S6e), som representerar flera positivt laddade rester på spermieytan.Intressant nog innehåller detta plåster en antikroppsepitop som tidigare har visats störa SPACA6 30-funktionen.Region 3 spänner över gångjärnet och en sida av den Ig-liknande domänen;denna region innehåller konserverade proliner (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) och utåtriktade polära/laddade rester.Överraskande nog är de flesta av resterna på ytan av 4HB mycket varierande (Fig. 6b), även om vecket är bevarat genom hela SPACA6-homologen (vilket indikeras av konservatismen hos den hydrofoba buntkärnan) och bortom IST-superfamiljen.
Även om detta är den minsta regionen i SPACA6 med de minsta detekterbara sekundära strukturelementen, är många gångjärnsregionrester (inklusive region 3) mycket konserverade bland SPACA6-homologer, vilket kan indikera att orienteringen av det spiralformade knippet och β-sandwich spelar en roll.som konservativ.Trots omfattande vätebindning och elektrostatiska nätverk i gångjärnsregionen i SPACA6 och IZUMO1, kan dock bevis på inneboende flexibilitet ses i anpassningen av de flera tillåtna strukturerna av IZUMO137,43,44.Inriktningen av de individuella domänerna överlappade väl, men orienteringen av domänerna i förhållande till varandra varierade från 50 ° till 70 ° från den centrala axeln (Fig. S16).För att förstå konformationsdynamiken hos SPACA6 i lösning, utfördes SAXS-experiment (Fig. S17a, b).Ab initio rekonstruktion av SPACA6 ektodomän överensstämde med en stavkristallstruktur (Fig. S18), även om Kratky-plotten visade en viss grad av flexibilitet (Fig. S17b).Denna konformation står i kontrast till IZUMO1, där det obundna proteinet antar en boomerangform både i gittret och i lösning43.
För att specifikt identifiera den flexibla regionen utfördes väte-deuterium-utbytesmasspektroskopi (H-DXMS) på SPACA6 och jämfördes med data som tidigare erhållits på IZUMO143 (fig. 7a,b).SPACA6 är helt klart mer flexibel än IZUMO1, vilket framgår av det högre deuteriumutbytet i hela strukturen efter 100 000 s utbyte.I båda strukturerna visar den C-terminala delen av gångjärnsregionen en hög nivå av utbyte, vilket förmodligen tillåter begränsad rotation av 4HB och Ig-liknande domäner i förhållande till varandra.Intressant nog är den C-terminala delen av SPACA6-gångjärnet, bestående av 147CDLPLDCP154-resten, en mycket konserverad region 3 (Fig. 6b), vilket möjligen indikerar att interdomänflexibilitet är en evolutionärt konserverad egenskap hos SPACA6.Enligt flexibilitetsanalysen visade CD-termiska smältdata att SPACA6 (Tm = 51,2°C) är mindre stabil än IZUMO1 (Tm = 62,9°C) (Fig. S1e och S19).
a H-DXMS-bilder av SPACA6 och b IZUMO1.Det procentuella deuteriumutbytet bestämdes vid de angivna tidpunkterna.Nivåer av väte-deuterium-utbyte indikeras med färg på en gradientskala från blått (10%) till rött (90%).Svarta lådor representerar områden med hög utbyte.Gränserna för 4HB, gångjärn och Ig-liknande domän som observeras i kristallstrukturen visas ovanför den primära sekvensen.Deuteriumutbytesnivåer vid 10 s, 1000 s och 100 000 s plottades på ett remsdiagram ovanpå de transparenta molekylära ytorna av SPACA6 och IZUMO1.Delar av strukturer med en deuteriumutbytesnivå under 50 % färgas vita.Områden över 50 % H-DXMS-utbyte är färgade i en gradientskala.
Användningen av genetiska strategier för CRISPR/Cas9 och musgen knockout har lett till identifieringen av flera faktorer som är viktiga för bindning och fusion av spermier och ägg.Bortsett från den välkarakteriserade interaktionen mellan IZUMO1-JUNO och CD9-strukturen, förblir de flesta proteinerna associerade med gametfusion strukturellt och funktionellt gåtfulla.Den biofysiska och strukturella karakteriseringen av SPACA6 är en annan del av det molekylära vidhäftnings-/fusionspusslet under befruktning.
SPACA6 och andra medlemmar av IST-superfamiljen verkar vara mycket konserverade i däggdjur såväl som enskilda fåglar, reptiler och amfibier;i själva verket tros det att SPACA6 till och med krävs för befruktning i zebrafisk 59. Denna fördelning liknar andra kända könsfusionsassocierade proteiner såsom DCST134, DCST234, FIMP31 och SOF132, vilket tyder på att dessa faktorer är HAP2-deficienta (också kända som GCS1) proteiner som är ansvariga för den katalytiska aktiviteten hos många protister., växter och leddjur.Befruktade fusionsproteiner 60, 61. Trots den starka strukturella likheten mellan SPACA6 och IZUMO1, resulterade knockout av gener som kodar för något av dessa proteiner i infertilitet hos möss av hankön, vilket indikerar att deras funktioner i gametfusion inte dupliceras..Mer allmänt är inget av de kända spermieproteinerna som krävs för adhesionsfasen av fusion överflödiga.
Det är fortfarande en öppen fråga om SPACA6 (och andra medlemmar av IST-superfamiljen) deltar i intergametiska förbindelser, bildar intragametiska nätverk för att rekrytera viktiga proteiner till fusionspunkter, eller kanske till och med fungerar som svårfångade fusogener.Samimmunoprecipitationsstudier i HEK293T-celler avslöjade en interaktion mellan fullängds IZUMO1 och SPACA632.Våra rekombinanta ektodomäner interagerade emellertid inte in vitro, vilket tyder på att interaktionerna som ses i Noda et al.var båda deleterade i konstruktionen (notera den cytoplasmatiska svansen av IZUMO1, som har visat sig vara onödig för befruktning62).Alternativt kan IZUMO1 och/eller SPACA6 kräva specifika bindningsmiljöer som vi inte reproducerar in vitro, såsom fysiologiskt specifika konformationer eller molekylära komplex som innehåller andra proteiner (kända eller ännu inte upptäckta).Även om IZUMO1-ektodomänen tros förmedla vidhäftning av spermier till ägget i perivitellina utrymmet, är syftet med SPACA6-ektodomänen oklar.
Strukturen av SPACA6 avslöjar flera konserverade ytor som kan vara involverade i protein-protein-interaktioner.Den konserverade delen av gångjärnsregionen omedelbart intill CXXC-motivet (betecknad Patch 1 ovan) har flera utåtriktade aromatiska rester som ofta är associerade med hydrofoba och π-staplingsinteraktioner mellan biomolekyler.De breda sidorna av den Ig-liknande domänen (region 2) bildar ett positivt laddat spår med högkonserverade Arg- och His-rester, och antikroppar mot denna region har tidigare använts för att blockera gametfusion 30 .Antikroppen känner igen den linjära epitopen 212RIRPAQLTHRGTFS225, som har tre av de sex argininresterna och mycket konserverad His220.Det är inte klart om dysfunktionen beror på blockering av dessa specifika rester eller hela regionen.Placeringen av denna lucka nära C-terminalen av β-sandwichen indikerar cis-interaktioner med närliggande spermieproteiner, men inte med oocytproteiner.Vidare kan bibehållandet av en mycket flexibel prolinrik härva (plats 3) inom gångjärnet vara platsen för en protein-protein-interaktion eller, mer troligt, indikera bibehållandet av flexibilitet mellan de två domänerna.Kön är viktigt för SPACA6s okända roll.fusion av könsceller.
SPACA6 har egenskaper hos intercellulära adhesionsproteiner, inklusive Ig-liknande β-smörgåsar.Många adhesiva proteiner (t.ex. cadheriner, integriner, adhesiner och IZUMO1) har en eller flera β-sandwichdomäner som sträcker sig proteiner från cellmembranet till deras miljömål63,64,65.Den Ig-liknande domänen av SPACA6 innehåller också ett motiv som vanligtvis finns i β-smörgåsar av vidhäftning och kohesion: dubbletter av parallella strängar i ändarna av β-smörgåsar, kända som mekaniska klämmor66.Man tror att detta motiv ökar motståndet mot skjuvkrafter, vilket är värdefullt för proteiner involverade i intercellulära interaktioner.Men trots denna likhet med adhesiner finns det för närvarande inga bevis för att SPACA6 interagerar med äggvita.SPACA6-ektodomänen kan inte binda till JUNO, och SPACA6-uttryckande HEK293T-celler, som visas här, interagerar knappast med oocyter som saknar zona 32.Om SPACA6 etablerar intergametiska bindningar kan dessa interaktioner kräva posttranslationella modifieringar eller stabiliseras av andra spermieproteiner.Till stöd för den senare hypotesen binder IZUMO1-defekta spermier till oocyter, vilket visar att andra molekyler än IZUMO1 är involverade i könscellsadhesionssteget 27 .
Många virala, cellulära och utvecklingsfusionsproteiner har egenskaper som förutsäger deras funktion som fusogener.Till exempel har virala fusionsglykoproteiner (klass I, II och III) en hydrofob fusionspeptid eller loop i änden av proteinet som sätts in i värdmembranet.Hydrofilicitetskartan för IZUMO143 och strukturen (bestämd och förutspådd) för IST-superfamiljen visade ingen uppenbar hydrofob fusionspeptid.Således, om några proteiner i IST-superfamiljen fungerar som fusogener, gör de det på ett sätt som skiljer sig från andra kända exempel.
Sammanfattningsvis förblir funktionerna hos medlemmarna i IST-superfamiljen av proteiner associerade med gametfusion ett lockande mysterium.Vår karakteriserade SPACA6 rekombinanta molekyl och dess upplösta struktur kommer att ge insikt i relationerna mellan dessa delade strukturer och deras roll i gamete vidhäftning och fusion.
DNA-sekvensen som motsvarar den förutsagda humana SPACA6-ektodomänen (NCBI accessionsnummer NP_001303901.1; resterna 27–246) kodonoptimerades för uttryck i Drosophila melanogaster S2-celler och syntetiserades som ett genfragment med sekvensen som kodar för Kozak (Eurofins Genomics)., BiP-utsöndringssignalen och motsvarande 5'- och 3'-ändar för ligeringsoberoende kloning av denna gen i en pMT-expressionsvektor baserad på en metallotioneinpromotor modifierad för selektion med puromycin (pMT-puro).pMT-puro-vektorn kodar för ett trombinklyvningsställe följt av en 10x-His C-terminal tag (Figur S2).
Stabil transfektion av SPACA6 pMT-puro-vektorn in i D. melanogaster S2 (Gibco)-celler utfördes på liknande sätt som protokollet som används för IZUMO1 och JUNO43.S2-celler tinades och odlades i Schneiders medium (Gibco) kompletterat med en slutlig koncentration av 10% (v/v) värmeinaktiverat fetalt kalvserum (Gibco) och 1X antimykotisk antibiotikum (Gibco).Tidig passage-celler (3,0 x 106 celler) ströks ut i individuella brunnar med 6-brunnars plattor (Corning).Efter 24 timmars inkubation vid 27°C transfekterades celler med en blandning av 2 mg av SPACA6 pMT-puro-vektorn och Effectene-transfektionsreagens (Qiagen) enligt tillverkarens protokoll.Transfekterade celler inkuberades under 72 timmar och skördades sedan med 6 mg/ml puromycin.Celler isolerades sedan från komplett Schneiders medium och placerades i serumfritt Insect-XPRESS-medium (Lonza) för storskalig proteinproduktion.En 1 L sats av S2-cellkultur odlades till 8–10 × 106 ml-1 celler i en 2 L ventilerad flatbottnad polypropen Erlenmeyer-kolv och steriliserades sedan med en slutlig koncentration av 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) och sterilfiltrerades.inducerad.De inducerade kulturerna inkuberades vid 27°C vid 120 rpm under fyra dagar.
Konditionerat medium innehållande SPACA6 isolerades genom centrifugering vid 5660 xg vid 4°C följt av ett Centramate tangentiellt flödesfiltreringssystem (Pall Corp) med ett 10 kDa MWCO-membran.Applicera koncentrerat medium innehållande SPACA6 på en 2 ml Ni-NTA-agaroshartskolonn (Qiagen).Ni-NTA-hartset tvättades med 10 kolonnvolymer (CV) buffert A och sedan tillsattes 1 CV buffert A för att ge en slutlig imidazolkoncentration av 50 mM.SPACA6 eluerades med 10 ml buffert A kompletterad med imidazol till en slutlig koncentration av 500 mM.Restriktionsklass trombin (Millipore Sigma) tillsattes direkt till dialysslangen (MWCO 12-14 kDa) vid 1 enhet per mg SPACA6 mot 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 och 150 mM NaCl (buffert B) för dialys.30 (MgS04) vid 4°C under 48 timmar.Det trombinklyvda SPACA6 späddes sedan tre gånger för att minska saltkoncentrationen och laddades på en 1 ml MonoS 5/50 GL katjonbytarkolonn (Cytiva/GE) ekvilibrerad med 10 mM Tris-HCl, pH 7,5.Katjonbytaren tvättades med 3 CV av 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, sedan eluerades SPACA6 med en linjär gradient av O till 500 mM NaCl i 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 för 25 CV.Efter jonbyteskromatografi koncentrerades SPACA6 till 1 ml och eluerades isokratiskt från en ENrich SEC650 10 x 300 kolonn (BioRad) ekvilibrerad med buffert B. Enligt kromatogrammet poolades och koncentratfraktioner innehållande SPACA6.Renheten kontrollerades genom Coomassie-färgad elektrofores på en 16% SDS-polyakrylamidgel.Proteinkoncentrationen kvantifierades genom absorbans vid 280 nm med användning av Beer-Lambert-lagen och den teoretiska molära extinktionskoefficienten.
Renat SPACA6 dialyserades över natten mot 10 mM natriumfosfat, pH 7,4 och 150 mM NaF och späddes till 0,16 mg/ml före analys med CD-spektroskopi.Spektral scanning av CD-skivor med en våglängd på 185 till 260 nm uppsamlades på en Jasco J-1500 spektropolarimeter med användning av kvartskyvetter med en 1 mm optisk väglängd (Helma) vid 25°C med en hastighet av 50 nm/min.CD-spektra korrigerades baseline, medelvärde över 10 förvärv och omvandlade till genomsnittlig restellipticitet (θMRE) i grader cm2/dmol:
där MW är molekylvikten för varje prov i Da;N är antalet aminosyror;θ är ellipticiteten i milligrader;d motsvarar längden på den optiska banan i cm;proteinkoncentration i enheter.