310 10*1 mm lindade rör av rostfritt stål kemisk komponent, de N-terminala domänerna av spidroin bildar hydrogeler baserade på amyloidfibriller och ger en plattform för proteinimmobilisering.

Tack för att du besöker Nature.com.Du använder en webbläsarversion med begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Dessutom, för att säkerställa löpande support, visar vi webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Reglage som visar tre artiklar per bild.Använd bakåt- och nästaknapparna för att flytta genom bilderna, eller skjutkontrollknapparna i slutet för att flytta genom varje bild.

Specifikation

310 10*1mm Rostfritt stål spiralrör leverantörer

Kemisk sammansättning

Mekaniska egenskaper

Rekombinanta spindelsilkeproteiner (spider silk proteiner) har många potentiella tillämpningar i utvecklingen av nya biomaterial, men deras multimodala och aggregationsbenägna natur gör dem svåra att få tag på och lätta att använda.Här rapporterar vi att rekombinanta miniatyr spidroinproteiner och, viktigare, den N-terminala domänen (NT) själv snabbt bildar självbärande och transparenta hydrogeler vid 37 ° C.fusionsproteiner bestående av NT och grönt fluorescerande protein eller purinukleosidfosforylas bildar fullt funktionella fusionsproteiner.Hydrogeler.Våra resultat visar att rekombinanta NT- och fusionsproteiner ger höga uttrycksutbyten och ger hydrogeler attraktiva egenskaper såsom transparens, gelning utan tvärbindning och direkt immobilisering av aktiva proteiner vid hög densitet.
Spindlar har så många som sju olika uppsättningar silkeskörtlar, som var och en producerar en specifik typ av silke.Alla sju silkesarter är sammansatta av spindelsilkeproteiner (spidroiner) cirka 6000 rester långa och innehåller en stor central repeterande region omgiven av sfäriska N- och C-terminala domäner (NT och CT)1,2.Den mest studerade typen av siden, den primära ampullan, produceras av den primära ampullan.I denna körtel syntetiserar ett monolager av epitelceller spidroinproteiner och utsöndrar dem i körtelns lumen, där de finns i en löslig form (dopning) i extremt höga koncentrationer (30–50 % w/v)3,4.Organisationen och konformationen av de huvudsakliga ampulära spidroinproteinerna i körteln har diskuterats, men de flesta experimentella bevis indikerar närvaron av en allmänt spiralformad och/eller slumpmässig spiralformad konformation och micellära eller lamellära strukturer5,6,7,8,9,10.Medan de repetitiva domänerna reglerar silkesfibrernas mekaniska egenskaper, bildar β-ark nanokristaller och amorfa strukturer11,12,13,14,15, reglerar änddomäner silkesfibrer som svar på förändrade förhållanden längs sidenkörteln16,17,18.Genom att kontrollera silkesbildningen bevaras 19. Terminala domäner evolutionärt och deras funktion kan vara gemensam för alla spidroinproteiner 2,20,21.Under passage genom körteln sjunker spidroins pH från cirka 7,6 till < 5,716 och ökar med skjuvning och sträckning medierad av rörelse genom den gradvis avsmalnande kanalen.I lösning är CT en α-spiralformad konstitutiv parallell dimer17, men som svar på lågt pH och skjuvkrafter vecklas CT ut och byter β-lager16, 17, vilket möjligen utlöser β-lager i de repetitiva regionerna av Convert 16. NT är monomera under förhållanden som återspeglar förhållanden i lumen av körteln och medierar lösligheten av spidroin, men vid reducerat pH leder protonering av ett antal karboxylsyrasidokedjor till dimerisering av NT med ett pKa på cirka 6,5, vilket stabiliserar NT och fixerar spidroin i stort kvantiteter.nätverk16,18.Sålunda spelar NT en nyckelroll i filamentbildningen, och byter från en monomer i beläggningen till en dimer i fibern23,24,25.NT förblir mycket lösligt och spiralformigt under alla förhållanden som studerats hittills16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, vilket inspirerade dess utveckling som en löslighetsförbättrande märkning för produktion av heterologa proteiner.
Rekombinant minispindelsilkeprotein, bestående av en NT, en kort upprepningsregion, en CT och en His6-tagg (His-NT2RepCT) för rening, är lika lösligt i vattenhaltig buffert som naturligt spindelsilkeprotein och efterliknar naturliga viktiga egenskaper hos sidenspindel .täckning 25.31.His-NT2RepCT kan spinnas till kontinuerliga fibrer med hjälp av en biomimetisk maskin i vilken en pH 8 löslig beläggning extruderas i ett pH 525,32,33,34,35 vattenbad.Bioreaktorfermentering av E. coli som uttrycker His-NT2RepCT och efterföljande efterbehandling resulterade i >14 g/L utbyte efter rening.Det höga utbytet, den höga lösligheten och det adekvata svaret av His-NT2RepCT på sura förhållanden tillskrivs alla NT23, 25, 34.
Här rapporterar vi den snabba bildandet av transparenta hydrogeler från rekombinanta spidroinproteiner, inklusive NT enbart, genom att inkubera en proteinlösning vid 37 ° C.Med hjälp av tioflavin T fluorescens (ThT), Fourier transform infraröd spektroskopi (FTIR), kärnmagnetisk resonansspektroskopi (NMR) och transmissionselektronmikroskopi (TEM), fann vi att NT och mikrospiderproteiner genomgår strukturell transformation till β-ark och amyloidliknande fibriller när geler bildas.Dessutom bildar fusionsproteiner av NT och grönt fluorescerande protein (GFP) eller purinnukleosidfosforylas (PNP) hydrogeler med fullt funktionella fusionsfragment.Uttryck med hög genomströmning i heterologa värdar, i kombination med snabb bildning av hydrogeler under fysiologiska förhållanden, öppnar möjligheten för kostnadseffektiv produktion av hydrogeler med konstruerade funktioner.
Till skillnad från de flesta rapporterade rekombinanta spidroinproteiner36 är His-NT2RepCT stabil i Tris-HCl-buffert vid pH 8 och kan koncentreras upp till 500 mg/ml utan utfällning25.Därför blev vi förvånade över att finna att detta protein snabbt bildar optiskt klara, självbärande hydrogeler när det inkuberas vid 37°C (Fig. 1b-d).Ytterligare studier visade att His-NT2RepCT gelning inträffade över ett brett spektrum av proteinkoncentrationer (10–300 mg/ml) och att denna koncentration var omvänt korrelerad med gelningstiden (fig. 1c och kompletterande fig. 1).För att ta reda på vilka delar av His-NT2RepCT som förmedlar hydrogelbildning, undersökte vi sedan varje domän individuellt och i olika kombinationer med hjälp av en kolvinversionsanalys (Figur 1a, b).Alla testade fraktioner av rekombinant spidroin bildade geler (vid en proteinkoncentration av 300 mg/ml) på mindre än 1 timme, förutom utfälld 2Rep (Fig. 1b).Detta tyder på att enbart NT och CT, i kombination, eller associerade med upprepningar, kan gela vid 37°C och att His6-taggen inte påverkar denna process i någon betydande utsträckning.Med tanke på den vanliga uppfattningen att NT är ett mycket lösligt och stabilt protein, och att tidigare rapporter om rekombinanta spidroinhydrogeler har tillskrivit gelningseffekter till konformationsförändringar i upprepade regioner och/eller CT, kan NT självt.Upptäckten av gelning var oväntad.Kompletterande tabell 1) 37, 38, 39. Anmärkningsvärt nog gelerade NT redan inom 10 minuter vid en koncentration av ≥ 300 mg/ml (Fig. 1c).Inversionsexperiment från flaskor med olika koncentrationer av NT visade att vid >50 mg/ml gelerade NT-lösningen snabbare än His-NT2RepCT vid motsvarande koncentration (vikt/volym, figur 1c).
Schematisk representation av olika spidroin-konstruktioner som studerats i detta arbete.b Geltid vid 37 °C för olika rekombinanta spidroinproteiner (300 mg/ml) verifierad genom att vända flaskan.CT-gel omedelbart utan inkubation (<300 mg/ml), 2Rep fäller ut (300 mg/ml, 5 mm skala).c Geltid för His-NT2RepCT och NT vid angivna proteinkoncentrationer vid 37°C.d Fotografier av His-NT2RepCT- och NT-hydrogeler med spindeln respektive bokstaven "NT" tryckt under (båda 200 mg/ml, skala 5 mm).
Hydrogeler som bildas av olika rekombinanta spidroinproteiner har något olika färger, och observation med blotta ögat visar olika grader av transparens (Fig. 1b).NT-geler är exceptionellt klara medan andra geler blir ogenomskinliga.His-NT2RepCT och NT-geler gjutna i cylindriska rör kunde avlägsnas från formen intakta (Fig. Id).
För att testa om naturliga spindelsilkebeläggningar gelar under förhållanden som nu visat sig orsaka gelning av de rekombinanta spidroinproteinerna, samlades beläggningar från den stora ampullakörteln hos den svenska brospindeln (Larinioides sclopetarius).Beläggningar lagrades i 20 mM Tris-HCl-buffert vid 50 mg/ml (baserat på uppmätt torrvikt), men ingen gelning observerades under den 21 dagar långa inkubationen vid 37 °C (kompletterande figur 2a).
För att kvantifiera dessa geler kan reologiska mätningar användas för att studera gelningsprocessen och bestämma de övergripande mekaniska egenskaperna.I synnerhet kan övervakning av lagringsmodulen (elasticiteten) vid förhöjda temperaturer ge information om gelningstemperaturen såväl som de viskoelastiska egenskaperna hos beläggningen.Temperaturstegringsexperiment (med användning av 1°C/min vid 25-45°C, baserat på tidigare studier med naturliga silkesstamlösningar)40,41 visade att lagringsmodulerna för His-NT2RepCT- och NT-lösningar ökade med ökande temperatur.ökades (fig. 2 och tilläggsfig. 3).Noterbart började NT-modulen växa vid en lägre temperatur jämfört med His-NT2RepCT, i överensstämmelse med den snabbare geltiden som observerades när NT inkuberades direkt med His-NT2RepCT vid 37 ° C (Figur 1).Efter en efterföljande temperatursänkning återgick inte lagringsmodulen till lägre värden och förblev över förlustmodulen (se tilläggsbild 3), vilket indikerar termiskt irreversibel stabil gelning.Efter gelning varierade den slutliga elasticitetsmodulen från 15 till 330 kPa för His-NT2RepCT-hydrogeler vid en koncentration av 100–500 mg/ml, och den slutliga elasticitetsmodulen för NT-hydrogeler (100–500 mg/mL) varierade från 2 till 1400 kPa (Fig. , 2 och fullständiga rampdata) se Tilläggsbild 3).
a Förändring i temperatur under mätningar av His-NT2RepCT (300 mg/ml) och b NT (300 mg/ml) med skakning.Pilarna indikerar temperaturtrenden, och den ljusare skuggningen av lagringsmodulens data visar testning vid lägre vridmomentvärden för instrumentet än vad som anges av tillverkaren, vilket är orsaken till det ökade bruset.c Slutmodulackumulering av His-NT2RepCT och NT efter förhöjd temperatur (100, 300 och 500 mg/ml).Alla modulavläsningar tas med en frekvens på 0,1 Hz.
Som en potentiell metod för att undersöka konformationsförändringar associerade med gelning, registrerade vi FTIR-spektra av His-NT2RepCT och NT före och efter gelning vid 37 ° C (Figur 3a, b).Som förväntat motsvarade spektra av His-NT2RepCT- och NT-lösningar proteiner som visade α-helix/slumpspiral sekundär struktur, med ett uttalat band vid 1645 cm-1.För båda hydrogelerna resulterade gelning i bildandet av två armar i det mellersta I-bandet vid cirka 1617 cm-1 och 1695 cm-1 (fig. 3a, b), vilket indikerar bildandet av antiparallella p-arkstrukturer.Dessa förändringar kan också tydligt ses i respektive andra derivat och skillnadsgelningsspektra (kompletterande fig. 4b).De två banden i NT β-skiktet var mer uttalade än de för His-NT2RepCT, vilket indikerar att det totala innehållet av β-skiktsband i NT-hydrogelen var högre än det i NT2RepCT-hydrogelen.
ett FTIR-absorptionsspektra av His-NT2RepCT och b NT (båda 500 mg/ml) före (lösning) och efter (gel) inkubation vid 37°C.c TEM-bilder av resuspenderade 50 mg/ml NT2RepCT-geler och d NT.Skalstång 200 nm.e Fiberdiametrar för His-NT2RepCT och NT hydrogeler.n = 100 uppmätta fibriller, p < 0,0001.Felstaplarna visar standardavvikelsen.Mitten av felstaplarna är medelvärdet.Ett oparat t-test (tvåsidigt) användes för statistisk analys.f ThT-fluorescens av olika rekombinanta spidroinproteiner (100 mg/ml) vid 37 °C utan att skaka.g NT (100 mg/ml) ympningsexperiment från 100 mg/ml NT-gel med 0 %, 5 %, 10 % och 20 % frön.
Analys av gelén med användning av transmissionselektronmikroskopi (TEM) visade att hydrogelen består av amyloidliknande fibriller (fig. 3c, 3d).NT-bildade fibriller var långsträckta (5–12 nm i diameter) och ogrenade, medan His-NT2RepCT-fibriller var kortare i längd och betydligt bredare i diameter (7–16 nm) (Fig. 3e).Dessa resultat gjorde det möjligt för oss att följa kinetiken för fibros med hjälp av tioflavin T (ThT) analysen.För alla rekombinanta spidroinproteiner ökade den fluorescerande signalen när prover inkuberades vid 37 °C (Fig. 3f, Kompletterande Fig. 5a).I överensstämmelse med detta fynd avslöjade mikroskopisk undersökning av NT och His-NT2RepCT under gelningsbetingelser en enhetlig ökning av ThT-fluorescens utan märkbar lokal ackumulering av ThT-positiva aggregat (kompletterande fig. 5b, c).Bildandet av ThT-positiva fibriller åtföljdes inte av en ökning av NT- och His-NTCT-turbiditet (kompletterande fig. 5d), vilket innebär att ett nätverk av fibriller i gelén kunde bildas utan att kompromissa med gelens klarhet.Sådd genom att tillsätta små mängder av förformade fibriller kan avsevärt påskynda fibrillbildningen av vissa amyloider42,43,44 men tillsats av 5%, 10% eller 20% (w/w) NT till en lösning av NT hydrokoagulanter.ympningseffekt (fig. 3g).Kanske beror detta på att fibrillerna i hydrogelen är relativt fixerade och inte kan användas som frön.
Det oväntade beteendet hos rekombinanta spidroinproteiner vid höga temperaturer föranledde ytterligare kärnmagnetisk resonans (NMR) spektroskopistudier för att identifiera konformationsförändringar associerade med gelbildning.NMR-spektra av His-NT2RepCT-lösningar registrerade över tid vid 37°C visade att CT fortfarande var delvis vikt, medan NT- och 2Rep-signaler hade försvunnit (Fig. 4a), vilket tyder på att det huvudsakligen var NT och 2Rep som delvis kontrollerade bildningen av His- NT2RepCT hydrogel.CT-signalen dämpades också till 20 % av sin ursprungliga intensitet, vilket tyder på att CT också mestadels är fixerad och inkorporerad i hydrogelstrukturen.För en mindre del av CT, som är lika mobil som i det förinkuberade provet och således observerat med lösnings-NMR, saknar spektra signaler för de första 10 strukturerade resterna, möjligen på grund av svår immobilisering av den fästa delen av His-NT2Rep.NMR-spektra för -tillståndet av hydrogeler -NT2RepCT avslöjade den övervägande närvaron av a-helixar och β-skikt och, i mindre utsträckning, den slumpmässiga spolkonformationen (Fig. 4b).Kemisk skiftanalys av metioninrester närvarande endast i NT visade att denna domän hade omvandlats till en p-arkstruktur.De tidsberoende spektra för NT i lösning visade en enhetlig minskning i signalintensitet (fig. 4c), och fast-tillstånd-NMR av NT-hydrogeler visade att de flesta av NT-resterna omvandlades till p-arkstrukturer (fig. 4d).Konformationen av 2Rep kunde inte bestämmas separat på grund av dess tendens att aggregeras.Fasttillstånds-NMR-spektra för NTCT- och His-NT2RepCT-hydrogelerna såg emellertid väldigt lika ut (Fig. 4b; Kompletterande Fig. 6b), vilket tyder på att 2Rep bidrog lite till den strukturella delen av His-NT2RepCT-hydrogelen.För CT-hydrogeler befanns a-helixar, β-ark och slumpmässiga spiralformade sekundära strukturer existera (kompletterande fig. 6d).Detta tyder på att vissa delar av CT förblir α-helixar medan andra blir β-sheets.Resultaten av NMR-spektroskopi tyder således på att NT är viktigt för hydrogelbildning och även omvandlas till en β-arkkonformation vid fusion med 2Rep och CT.I överensstämmelse med detta fann vi nyligen att amyloida rumsliga blixtlås troligen bildas i alla fem helixar i NT-domänen, och Waltz-algoritmen förutspådde en amyloidogen region i helix 1 (Fig. 4e).
2D-spektra av 15N-HSQC 10 mg/ml His-NT2RepCT-lösning före (blå) och 19 timmar efter inkubation (röd) vid 37°C.Individuella korstoppar i det röda spektrumet och F24, G136, polyA i det blåa spektrumet betecknas med enbokstavs aminosyrasymboler och restnummer.Insättningarna visar beroendet av signalintensiteten i tid för utvalda rester från NT-, 2Rep- och CT-domänerna.b Solid-state radiofrekvens (RFDR) spektra för His-NT2RepCT hydrogeler.Korrelationer av Cα/Cβ-rester observerade i RFDR-spektra bestämdes genom jämförelse med kemiska skift av modellpeptider och värden härledda från statistik82,83 och deras sekundära strukturer.SSB – roterande sidband.c Endimensionella spektra av 15N-HSQC 10 mg/ml NT-lösning under inkubation vid 37 °C i 36 timmar.Insatsen visar volymetrisk intensitet kontra tid.d RFDR-spektra i fast tillstånd för NT-hydrogeler.Korrelationerna mellan Ca/Cp-rester och deras sekundära strukturer som observerats i RFDR-spektra indikeras.e Baserat på NT45.79-flimmerbenägenhetsprofilen från Zipper-databasen (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Rosetta-energin för det rumsliga blixtförskjutningsfönstret för hexapeptiden visas i kcal/mol.Röda staplar betecknar hexapeptider med hög fibrosbenägenhet (Rosetta-energi under -23 kcal/mol; under den streckade linjen).Gröna staplar indikerar fragment med Rosetta-energier över tröskeln och därför mindre benägna att bilda steriska dragkedjor.Fragment innehållande prolin exkluderades från analysen (utan kolonner).Kvadrater indikerar områden av amyloidos som förutspåtts av Waltz-algoritmen81 (https://waltz.switchlab.org).Sekvensen av aminosyrarester av NT är överst, och de typer av rester som finns i den sekundära β-strukturen (bestäms av fast-tillstånd NMR-spektroskopi) visas i rött.Positionerna för de fem NT a-helixarna betecknas som (H1-H5)28.
Vid pH <6,5 dimeriserar HT och är resistent mot värme- eller urea-inducerad denaturering18.För att klargöra hur NT-dimerisering och stabilitet påverkar gelning kontrollerades lösningar innehållande 100 mg/ml NT vid pH 8, 7 och 6 med användning av flaskinversionstestet.NT-prover inkuberade vid pH 8 och 7 gelade efter 30 minuter vid 37 °C, men pH 8-gelen förblev klar, medan pH 7-gelen visade en synlig fällning (fig. 5a).Däremot bildade en lösning innehållande HT vid pH 6 ingen gel, och en stor fällning kunde ses efter 20 minuter vid 37°C.Detta tyder på att dimererna själva och/eller deras högre stabilitet jämfört med monomerer förhindrar gelning.Bildandet av en fällning för NT vid pH 7 och 6 förväntades inte, eftersom det har rapporterats att NT är lösligt vid 200 mg/ml27, lätt återveckas efter värmedenaturering och även bibehåller en α-helix vid lägre värden av pH 18. En trolig förklaring till dessa avvikelser är att de tidigare rapporterade experimenten utfördes vid rumstemperatur eller lägre, eller vid relativt låga proteinkoncentrationer16,18,19.
NT-ampullinversionstest (100 mg/ml) vid pH 8, 7, 6 och 154 mM NaCl (pH 8) efter inkubation vid 37°C.b NT CD-spektra med och utan 154 mM NaF respektive 154 mM NaCl.Molar ellipticitet vid 222 nm omvandlas till en andel naturliga veck.c NT-inversionsanalys (100 mg/ml) NT* (37 °C och 60 °C), NTA72R (37 °C) och His-NT-L6 (37 °C och 60 °C).d CD-spektra av NT-mutanter NT*, NTA72R och His-NT-L6.Molar ellipticitet vid 222 nm omvandlas till en andel naturliga veck.e Inversionstest av NTFlSp, NTMiSp och reducerad NTMiSp (100 mg/ml).Skalstång 5 mm.f CD-spektra av NT, NTFlSp, NTMiSp och reducerad NTMiSp.Molar ellipticitet vid 222 nm omvandlas till en andel naturliga veck.Fullständiga NT-spektra vid 25 °C och 95 °C visas i tilläggsfigur 8.
Fysiologisk saltkoncentration bestämmer elektrostatiska interaktioner mellan NT-subenheter och dimerisering av NT-överföring till lägre pH18.Vi fann att närvaron av 154 mM NaCl och NaF verkligen hämmade gelning respektive (fig. 5a, b; kompletterande fig. 2b) och att dessa salter ökade den termiska stabiliteten hos NT-monomerer (fig. 5b, tilläggsfig. 8). .Det tyder också på att stabilitetsförbättring, snarare än dimerisering, förhindrar gelbildning.
För att ytterligare utforska rollen av proteindimerisering och stabilitet vid gelning använde vi två mutanter, NT* och NTA72R, som också förblir monomera vid lågt pH28,30.NT* är en dubbelladdningsomkastande mutant där den skenbara dipolära laddningsfördelningen av monomeren är tillplattad, vilket förhindrar dimerisering och drastiskt ökar monomerstabiliteten.NTA72R är en laddad dipol, men Arg-substituerad Ala är belägen vid dimergränsen, så mutationer interfererar med subenhetsinteraktioner som krävs för dimerisering.Vid inkubation vid 37°C bildade NT* ingen hydrogel, medan NTA72R bildade en ogenomskinlig gel under 15 minuter (fig. 5c).Eftersom både NT* och NTA72R inte kan dimerisera utan skiljer sig i monomerstabilitet (fig. 5d), tyder dessa resultat starkt på att hög termodynamisk stabilitet förhindrar NT från att gela.Detta stöds också av det faktum att HT* bildar en gel när den är instabil vid hög temperatur (efter 8 min vid 60°C; Fig. 5c).Det har tidigare visats att det höga innehållet av metionin i NT gör dess naturliga veckning flytande och att sex Met till Leu-ersättningar (här kallade His-NT-L6) starkt stabiliserar NT46-monomeren.Baserat på antagandet att strukturell flexibilitet krävs för NT-gelbildning, fann vi att den stabila His-NT-L6-mutanten inte gelerade vid 37 ° C (Figur 5c, d).His-NT-L6 bildade emellertid också en gel vid inkubation vid 60°C under 60 minuter (fig. 5c).
Förmågan hos NT att omvandla till p-arkstrukturer och bilda hydrogeler verkar gälla vissa men inte alla NT-domäner av spidroin.NT från olika sidentyper och spindelarter, Trichonephila clavipes (NTFlSp), bildade geler trots sin relativt låga metioninhalt och höga termiska stabilitet (fig. 5e, f och tilläggstabell 2).Däremot bildade NT från det lilla ampulära proteinet spidroin från Araneus ventricosus (NTMiSp) med låg termisk stabilitet och hög metioninhalt inte hydrogeler (kompletterande tabell 2 och fig. 5e, f).Det senare kan vara associerat med närvaron av intramolekylära disulfidbindningar29,47.Konsekvent, när disulfidbindningarna av NTMiSp reducerades, bildade den en hydrogel efter inkubation vid 37°C under 10 minuter (fig. 5e).Sammanfattningsvis bör det noteras att strukturell flexibilitet är ett viktigt, men inte det enda, kriteriet för bildandet av en gel från NT.En annan faktor som kan vara relevant är benägenheten att bilda amyloidfibriller, och analys med blixtlåsdatabasen och Waltz-algoritmen visade på en korrelation mellan förmågan att bilda geler och förekomsten av amyloidogena regioner, såväl som omfattningen av de förutspådda regionerna för att bilda steriska dragkedjor.Det fanns en korrelation (kompletterande tabell 2 och tilläggsbild 9).
Förmågan hos NT att bilda fibriller och bilda geler under gynnsamma förhållanden fick oss att anta att NT-fusioner med andra proteinfragment fortfarande kan bilda geler med full funktion av fusionspartners.För att testa detta introducerade vi grönt fluorescerande protein (GFP) och purinnukleosidfosforylas (PNP) vid C-terminalen av NT, respektive.De resulterande fusionsproteinerna uttrycktes i E. coli med mycket höga slutliga utbyten (150 mg/L och 256 mg/L skakkolvkulturer för His-NT-GFP respektive His-NT-PNP), i överensstämmelse med vad som har visats för Andra proteiner fuserade till NT Ref.30. His-NT-GFP (300 mg/ml) och His-NT-PNP (100 mg/ml) fusionsproteiner bildade geler efter 2 timmar och 6,5 timmar vid 37°C och, viktigare, GFP-fraktionen förblev oförändrad.observerades efter gelning, med >70 % av den initiala fluorescensintensiteten kvar efter gelning (Fig. 6a).För att mäta PNP-aktivitet i his-NT-PNP-lösningar och geler, var vi tvungna att späda fusionsproteinet med NT eftersom den enzymatiska aktiviteten hos det rena preparatet låg utanför analysens detektionsintervall vid gelningskoncentrationer.Gelén som bildades med en blandning innehållande 0,01 mg/ml His-NT-PNP och 100 mg/ml NT bibehöll 65 % av den initiala enzymatiska aktiviteten hos de förinkuberade proverna (fig. 6b).Gelén förblev intakt under mätningen (tilläggsbild 10).
a Relativ fluorescensintensitet före och efter gelning av His-NT-GFP (300 mg/ml) och inverterad flaska innehållande His-NT-GFP-hydrogel (300 mg/ml) under synligt och UV-ljus.Punkter visar individuella mätningar (n = 3), felstaplar visar standardavvikelse.Medelvärdet visas i mitten av felstaplarna.b PNP-aktivitet erhölls genom fluorometrisk analys med användning av lösningar och geler bestående av NT (100 mg/ml) och en blandning innehållande 0,01 mg/ml his-NT-PNP och 100 mg/ml New Taiwan dollar.Insatsen visar en inverterad flaska innehållande en hydrogel innehållande His-NT-PNP (5 mm skala).
Här rapporterar vi bildandet av hydrogeler från NT och andra rekombinanta spidroinproteiner genom att inkubera en proteinlösning vid 37 ° C (Figur 1).Vi visar att gelning är associerad med omvandlingen av α-helixar till β-skikt och bildandet av amyloidliknande fibriller (fig. 3 och 4).Detta fynd är överraskande eftersom NTs är spiralformade klotformade fem-helixbuntar kända för sin extremt höga löslighet och höga stabilitet vid koncentrationer >200 mg/ml vid 4°C under flera dagar27.Dessutom återveckas NTs lätt efter värmedenaturering vid låga proteinkoncentrationer i µM.Enligt våra resultat kräver fibrillbildning en kombination av >10 mg/ml proteinkoncentration och något förhöjd temperatur (Fig. 1).Detta överensstämmer med tanken att amyloidfibriller kan bildas från globulärt veckade proteiner som är i ett delvis oveckat tillstånd på grund av termiska fluktuationer under fysiologiska förhållanden 48 .Exempel på proteiner som genomgår denna omvandling inkluderar insulin49,50, β2-mikroglobulin, transtyretin och lysozym51,52,53.Även om NT är en α-helix i sitt naturliga tillstånd, är ungefär 65 % av polypeptidkedjan kompatibel med sterisk blixtlåsbildning (Fig. 4e) 45 .Eftersom monomeren är dynamiskt mobil46, kan den exponera dessa potentiella amyloidogena regioner vid måttligt förhöjda temperaturer och vid höga koncentrationer av totalt protein kan den nå en kritisk koncentration för bildning av amyloidfibriller54.Efter detta resonemang fann vi en negativ korrelation mellan spidroinkoncentration och gelningstid (Fig. 1c), och om den monomera NT-konformationen stabiliseras antingen av mutationer (NT*, His-NT-L6) eller genom salttillsats, kan det förhindra bildning av hydrogeler (fig. 5).
I de flesta fall försvinner amyloidfibriller från lösningen som en fällning, men under vissa förhållanden kan de bilda hydrogeler55,56,57.Hydrogelbildande fibriller har vanligtvis ett högt bildförhållande och bildar stabila tredimensionella nätverk genom molekylär intrassling,55,58 i överensstämmelse med våra resultat.För hydrogelbildning in vitro vecklas proteiner ofta ut helt eller delvis, till exempel genom exponering för organiska lösningsmedel, hög temperatur (70–90°C) och/eller lågt pH (1,5–3,0)59,60,61,62.De spidroinhydrogeler som beskrivs här kräver inte hård bearbetning, och de kräver inte heller tvärbindningsmedel för att stabilisera hydrogelerna.
Det har tidigare rapporterats att spidroin-repetitioner och QDs, som verkar genomgå β-sheet-byte under silkespinning, bildar hydrogeler.Jämfört med våra fynd var inkubationstiderna och/eller inkubationstemperaturerna signifikant längre respektive högre, och de resulterande hydrogelerna var ofta ogenomskinliga (Figur 7 och tilläggstabell 1) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Förutom snabba geltider överträffade NT-hydrogeler >300 mg/ml (30 %) alla andra beskrivna rekombinanta spindelsilkeproteinhydrogeler, såväl som naturliga hydrogeler som gelatin, alginat (2 %), agar (0,5 % ) och kollagen.(0,6%) (Figur 7 och kompletterande tabeller 1 och 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Geltiden och elasticitetsmodulen för hydrogelerna i denna studie jämfördes med andra spidroinbaserade hydrogeler och utvalda naturliga hydrogeler.Referenser ges tillsammans med en beskrivning av gelningsbetingelserna.APS Ammoniumpersulfat, rumstemperatur.Data 37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Spindlar verkar ha utvecklat sätt att förhindra spidroin från att gela under lagring.Trots den höga koncentrationen av protein i sidenkörteln betyder den stora upprepningsregionen associerad med den terminala domänen att den skenbara koncentrationen av NT och CT i körteln motsvarar cirka 10-20 mg/ml, vid gränsen för denna studie.krävs för observerad hydrogelbildning in vitro.Dessutom stabiliserade liknande koncentrationer av salter 16 NT, som i silkeskörtlar (fig. 5b).NT-konformation har studerats i E. coli-cytosolen och funnits vara tätare veckad än när den undersöktes in vitro, vilket ytterligare indikerar att salt eller andra faktorer förhindrar dess aggregering in vivo.Däremot kan förmågan hos NTs att omvandla till β-arkfibriller vara viktig för filamentbildning och bör undersökas i framtida studier.
Förutom de nya aspekterna av NT-amyloidliknande fibrill och hydrogelbildning som observerats i denna studie, visar vi också att detta fenomen kan ha biotekniska och biomedicinska tillämpningar (Fig. 8).Som ett bevis på konceptet kombinerade vi NT med GFP eller PNP och visade att fusionsproteinet också bildar hydrogeler när det inkuberas vid 37 ° C och att GFP- och PNP-fraktionerna till stor del behåller sin aktivitet efter gelning (Figur 6).Nukleosidfosforylaser är viktiga katalysatorer för syntes av nukleosidanaloger75, vilket gör vår upptäckt relevant för den biofarmaceutiska industrin.Konceptet att uttrycka fusionsproteiner som bildar transparenta hydrogeler under gynnsamma förhållanden tillåter skapandet av funktionaliserade hydrogeler med gynnsamma egenskaper för ett brett spektrum av applikationer såsom enzymimmobilisering, kontrollerad läkemedelsfrisättning och vävnadsteknik.Dessutom är NT och NT* effektiva uttrycksmarkörer30, vilket innebär att NT och dess varianter kan användas för högkapacitetsproduktion av lösliga fusionsproteiner och efterföljande skapande av immobiliserade målproteiner i 3D-hydrogeler.
NT är lösligt, α-helix och stabilt vid låga koncentrationer (µM) och 37°C.Vid samma temperatur, men vid ökande koncentrationer (>10 mg/ml), bildar NT geler som består av amyloidliknande fibriller.NT-fusionsproteiner bildar också fibrillära geler med fullt funktionella fusionsfragment, vilket gör att olika proteiner kan immobiliseras i 3D-hydrogeler med användning av NT.Nederst: NT (PDB: 4FBS) och illustrationer av fibernätverk och associerade proteinstrukturer (antagna och inte skalenliga, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ).
Konstruktionerna (se kompletterande tabell 4 för en fullständig lista inklusive aminosyrasekvenser) klonades in i plasmiden pT7 och transformerades till E. coli BL21 (DE3).E. coli innehållande manipulerade plasmider inokulerades i Luria-buljong kompletterad med kanamycin (70 mg/l) och odlades över natten vid 30°C och 250 rpm.Kulturen inokulerades sedan 1/100 i LB-medium innehållande kanamycin och odlades vid 30°C och 110 rpm tills OD600 nådde 0,8.För NMR-studier odlades bakterier i M9 minimalt medium innehållande 2 g D-glukos 13C (Aldrich) och 1 g ammoniumklorid 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) för proteinmärkning med isotoper.Sänk temperaturen till 20 grader Celsius och inducera proteinuttryck med 0,15 mM isopropyltiogalaktopyranosid (slutkoncentration).Efter proteinuttryck över natten skördades cellerna vid 7278 xg, 4°C under 20 minuter.Cellpellets återsuspenderades i 20 mM Tris-HCl, pH 8, och frystes tills vidare.Upptinade celler lyserades med användning av en cellavbrytare (TS-seriens maskiner, Constant Systems Limited, England) vid 30 kPa.Därefter centrifugerades lysaten vid 25 000 g under 30 minuter vid 4°C.För NTMiSp resuspenderades pelleten sedan i 2 M urea, 20 mM Tris-HCl, pH 8, och sonikerades i 2 minuter (2 s på/av, 65%), centrifugerades sedan igen vid 25 000 xg, 4°C inom 30 minuter.Supernatanten laddades på en Ni-NTA-kolonn, tvättades med 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazol, pH 8, och slutligen eluerades proteinet med 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazol, pH 8. För att generera NT2RepCT och NTCT, trombindigestion introducerar platsen (ThrCleav) mellan His och NT.Trombinklyvningsställen finns också i His-NT-ThrCleav-2Rep (producerar 2Rep), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (producerar NT), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (producerar CT), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT .* (producerar NT*), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (producerar NTA72R), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (producerar NTF1Sp) och His-Svavelredoxin-ThrCleav-NTMiSp (producerar NTMiSp).Konstruktionerna digererades med trombin (1:1000) och dialyserades över natten vid 4°C med 20 mM Tris-HCl, pH 8, med användning av ett Spectra/Por-dialysmembran med en molekylviktströskel på 6-8 kDa.Efter dialys laddas lösningen på en Ni-NTA-kolonn och effluenten som innehåller proteinet av intresse samlas upp.Proteinkoncentrationer bestämdes genom att mäta UV-absorbans vid 280 nm med användning av extinktionskoefficienten för varje protein, förutom NTF1Sp, som använde Bradford-analysen enligt tillverkarens protokoll.Renhet bestämdes genom SDS-polyakrylamid (4–20 %) gelelektrofores och Coomassie briljantblå färgning.Proteiner koncentrerades med användning av centrifugfilter (VivaSpin 20, GE Healthcare) vid 4000 xg med en 10 kDa molekylviktsgräns i 20 minuters cykler.
Tina proteinlösningen och pipettera försiktigt 150 µl i en 1 ml klar septumflaska (8 x 40 mm Thermo Scientific).Rören förslöts och förseglades med parafilm för att förhindra avdunstning.Prover (n = 3) inkuberades vid 37°C eller 60°C och inverterades periodiskt för att observera gelning.Prover som inte gelerade inkuberades i minst en vecka.Minska NTMiSp-disulfidbindningar med 10 mM DTT per 10 µM protein.För att analysera gelningen av naturliga spindelsilkebeläggningar skars den svenska brospindeln, de två ampulerade huvudkörtlarna placerades i 200 μl 20 mM Tris-HCl-buffert pH 8 och skars så att beläggningen kunde separera från körtlarna..Innehållet i körtlarna löses i buffert, 50 µl för bestämning av torrvikt (genom inkubering av öppna flaskor vid 60 °C till konstant vikt) och 150 µl för gelning vid 37 °C.
Mätgeometrin/verktyget är tillverkat av rostfritt stål med en parallell platta med en toppdiameter på 20 mm och ett mellanrum på 0,5 mm.Värm provet från 25 °C till 45 °C och tillbaka till 25 °C med en hastighet av 1 °C per minut med hjälp av en Peltier-platta i rostfritt stål.Vibrationsmätningar utfördes med en frekvens på 0,1 Hz och i materialets linjära viskoelastiska område med en töjning på 5 % och 0,5 % för prover på 100 mg/ml respektive 300–500 mg/ml.Använd en anpassad fuktkammare för att förhindra avdunstning.Data analyserades med Prism 9.
För insamling av infraröda (IR) spektra vid rumstemperatur från 800 till 3900 cm–1.ATR-anordningen, såväl som ljusvägen genom spektrometern, renas med torr filtrerad luft före och under experimentet.Lösningar (500 mg/ml för att minimera vattenabsorptionstoppar i spektrat) pipetterades på kristallerna och geler (500 mg/ml) bildades före mätning och överfördes sedan till kristallerna (n = 3).1000 skanningar registrerades med en upplösning på 2 cm-1 och noll arbetscykel på 2. Den andra derivatan beräknades med OPUS (Bruker) med användning av ett utjämningsintervall på nio punkter.Spektrana normaliserades till samma integrationsregion mellan 1720 och 1580 cm-1 med användning av F. Menges "Spectragryph – Optical Spectroscopy Software".I ATR-IR-spektroskopi är penetrationsdjupet för en infraröd stråle i ett prov vågtalsberoende, vilket resulterar i starkare absorption vid lägre vågtal än vid högre vågtal.Dessa effekter har inte korrigerats för de spektra som visas i Fig.3 eftersom de är mycket små (tilläggsbild 4).Korrigerade spektra för denna figur beräknades med användning av programvaran Bruker OPUS.
I princip är en omfattande kvantifiering av proteinkonformationer möjlig efter tillförlitlig dekonvolution av komponenterna inom amid I-toppen.Vissa hinder uppstår dock i praktiken.Brus i spektrumet kan uppträda som (falska) toppar under dekonvolution.Dessutom sammanfaller toppen på grund av vattenböjning med positionen för amid I-toppen och kan ha en liknande storlek för prover som innehåller en stor mängd vatten, såsom den vattenhaltiga gelen som studeras här.Därför försökte vi inte att helt sönderdela amid I-toppen, och våra observationer bör endast övervägas till stöd för andra metoder som NMR-spektroskopi.
Lösningar av 50 mg/ml NT och His-NT2RepCT gelades över natten vid 37°C.Hydrogelen späddes sedan med 20 mM Tris-HCl (pH 8) till en koncentration av 12,5 mg/ml, skakades väl och pipetterades för att bryta gelén.Därefter späddes hydrogelen ut 10 gånger med 20 mM Tris-HCl (pH 8), 5 μl av provet applicerades på ett koppargaller belagt med formvar och överskottet av provet avlägsnades med läskpapper.Proverna tvättades två gånger med 5 µl MilliQ-vatten och färgades med 1 % uranylformiat under 5 minuter.Ta bort överflödig fläck med absorberande papper och lufttorka sedan nätet.Avbildning utfördes på dessa galler med användning av en FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN som arbetar vid 100 kV.Bilderna spelades in med x 26 500 och x 43 000 förstoringar med en Veleta 2k × 2k CCD-kamera (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Tyskland).För varje prov (n = 1) spelades 10–15 bilder in.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) användes för bildanalys och mätning av fiberdiametrar (n = 100, olika fibrer).Prisma 9 användes för att utföra oparade t-tester (tvåsidigt).De genomsnittliga His-NT2RepCT- och NT-fibrillerna var 11,43 (SD 2,035) respektive 7,67 (SD 1,389) nm.Konfidensintervallet (95%) är -4,246 till -3,275.frihetsgrader = 198, p < 0,0001.
80 µl vätskeprov innehållande 10 µM tioflavin T (ThT) mättes i tre exemplar (n = 3) under statiska förhållanden med användning av Corning 96-brunnars svartbotten genomskinliga bottenplattor (Corning Glass 3881, USA).Fluorescensskillnader registrerades med användning av ett 440 nm excitationsfilter och ett 480 nm emissionsfilter (FLUOStar Galaxy från BMG Labtech, Offenburg, Tyskland).ThT-signalen var varken mättad eller släckt, eftersom experiment med olika koncentrationer av ThT utfördes utan att ändra signalintensiteten.Registrera absorbansen vid 360 nm för dimmighetsmätning.För ympningsexperiment bildades 100 mg/ml geler vid 37°C, återsuspenderades och användes för ympning vid molförhållanden på 5 %, 10 % och 20 %.Data analyserades med Prism 9.
Tina lager av His-NT2RepCT och NT >100 mg/ml på is och filtrera genom ett 0,22 µm filter.Koncentrationer beräknades genom att mäta absorbans vid 280 nm med användning av Nanodrop.I brunnar på en svart icke-bindande platta med 96 brunnar (Corning) med en klar botten späddes proverna till 20 mg/ml i 20 mM Tris-HCl pH 8 och blandades med 5 μM ThT (slutkoncentration), total provkoncentration 50 μl volym.Prover avbildades var tionde minut vid 37 ° C på ett CellObserver (Zeiss) mikroskop med transmitterad ljuskanal och FITC excitations- och emissionsfilteruppsättningar för ThT-avbildning.En 20x/0,4-lins används för bildbehandling.Zen Blue (Zeiss) och ImageJ (https://imagej.nih.gov/) användes för bildanalys.Geler framställdes också från NT- och His-NT2RepCT-lösningar vid en koncentration av 50 mg/ml innehållande 20 mM Tris pH 8 och 5 µM ThT och inkuberades vid 37°C under 90 min.Gelbitarna överfördes till en ny brunn innehållande 20 mM Tris, pH 8 och 5 μM ThT i en icke-bindande svart 96 brunnars klar bottenplatta.Skaffa grön fluorescens och ljusa fältbilder med 20x/0,4 förstoring.ImageJ användes för bildanalys.
Lösnings-NMR-spektra erhölls vid 310 K på en 600 MHz Bruker Avance Neo-spektrometer utrustad med en QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN).NMR-prover innehållande 10 mg/ml homogent protein märkt med 13C, 15N, löst i 20 mM Tris-HCl (pH 8), 0,02 % (vikt/volym) NaN3, 5 % DO (volym/volym), (n = 1) .Kemiska förskjutningar av NT2RepCT vid pH 6,7 användes för att tilldela topp 23 i 2D-spektrumet av 15N-HSQC.
Magisk vinkelsnurrande fast NMR (MAS)-spektra av 13C, 15N-märkta hydrogeler registrerades på en Bruker Avance III HD-spektrometer vid 800 MHz utrustad med en 3,2 mm 13C/15N{1H} elektronlös sond.Provtemperaturen kontrollerades med användning av en gasström med variabel temperatur vid 277 K. Tvådimensionell dipolrotationsresonans (DARR)76 och radiofrekvensåterkoppling (RFDR)77-spektra erhölls vid MAS-frekvenser på 12,5 kHz respektive 20 kHz.Korspolarisering (CP) från 1H till 13C utfördes med en linjär ramp från 60,0 till 48,0 kHz vid 1H, 61,3/71,6 kHz vid 13C (vid 12,5/20 kHz MAS) och kontakttid 0,5–1 ms.Spinal6478-avkoppling vid 73,5 kHz användes under datainsamling.Insamlingstiden var 10 millisekunder och cykelfördröjningen var 2,5 sekunder.De enkellänkade Cα/Cβ-korrelationerna som observerades i RFDR-spektra tilldelades baserat på de karakteristiska kemiska förskjutningarna av resttyp och multipellänkade korrelationer i DARR-spektra.
Zipper79-databasen (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) användes för att utvärdera fladdertendenser och Rosetta-energi för NT, NTFlSp och NTMiSp.Zipper-databasen beräknar Rosetta Energy80, som kombinerar flera gratis energifunktioner för att modellera och analysera proteinstruktur.En energinivå på -23 kcal/mol eller lägre indikerar en hög tendens att flimmer.Den lägre energin betyder mer stabilitet hos de två β-strängarna i blixtlåskonformationen.Dessutom användes Waltz-algoritmen för att förutsäga amyloidogena regioner i NT, NTFlSp och NTMiSp Ref.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT-proteinlösningen blandades med 2-(N-morfolino)etansulfonsyra (MES) buffert vid pH 5,5 och 6,0 för att sänka pH till pH 6 respektive 7.Den slutliga proteinkoncentrationen var 100 mg/ml.
Mätningar utfördes på en J-1500 CD-spektrometer (JASCO, USA) med en 300 μL kyvett med en optisk bana på 0,1 cm.Proteiner späddes till 10 μM (n = 1) i 20 mM fosfatbuffert (pH 8).För att analysera proteinstabilitet i närvaro av salt analyserades proteiner vid samma koncentration (n = 1) i 20 mM fosfatbuffert (pH 8) innehållande 154 mM NaF respektive NaCl.Temperaturskanningar registrerades vid 222 nm från 25°C till 95°C med en uppvärmningshastighet på 1°C/min.Andelen naturligt vikta proteiner beräknades med formeln (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal).Dessutom registrerades fem spektra för varje prov från 260 nm till 190 nm vid 25°C och efter upphettning till 95°C.Fem spektra medelvärdesbildades, utjämnades och omvandlades till molar ellipticity.Data analyserades med Prism 9.
Fluorescensintensiteten för His-NT-GFP (300 mg/ml, 80 µL) mättes i tre exemplar (n = 3) i 96-brunnars Corning-plattor med en svart transparent botten (Corning Glass 3881, USA) under statiska förhållanden.Mät prover med en fluorescensbaserad plattläsare med en excitationsvåglängd på 395 nm och registrera emissionen vid 509 nm före gelning och 2 timmar senare vid 37 °C.Data analyserades med Prism 9.
Purin-nukleosid-fosforylasaktivitetsanalyssats (fluorometrisk metod, Sigma Aldrich) användes enligt tillverkarens instruktioner.För att mäta aktiviteten i geler och lösningar som innehåller His-NT-PNP, blanda 10 ng His-NT-PNP med 100 mg/ml NT till en total volym av 2 µL eftersom gelén gav en signal över detektionsintervallet för setet.Kontroller för geler och lösningar utan His-NT-PNP inkluderades.Mätningarna utfördes två gånger (n = 2).Efter att aktiviteten mätts avlägsnades reaktionsblandningen och gelén fotograferades för att säkerställa att gelén förblev intakt under mätningen.Data analyserades med Prism 9.
För mer information om studiedesign, se Nature study abstract länkat till den här artikeln.
Figurerna 1 och 2 visar initialdata.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f och 6, kompletterande figurer.3, tilläggsfig.5a, d, tilläggsfig.6 och tilläggsfig.8. Data Data från denna studie finns i Zenodo-databasen https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.NMR-data som erhölls i denna studie postades till BMRBig-förvaret under posten ID bmrbig36.Strukturerna för GFP och PNP togs från PDB (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. och Johansson, J. Spinning av konstgjord spindelsilke.National Chemical.biologi.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Nephila clavipes-genomet belyser mångfalden av spindelsilkegener och deras komplexa uttryck.National Genette.49, 895–903 (2017).