347 12,7*1,24 mm lindade rör i rostfritt stål, molekylär mekanism för synkron elektrostatisk kondensation och koaggregering av α-synuklein och tau

Tack för att du besöker Nature.com.Du använder en webbläsarversion med begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Dessutom, för att säkerställa löpande support, visar vi webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Reglage som visar tre artiklar per bild.Använd bakåt- och nästaknapparna för att flytta genom bilderna, eller skjutkontrollknapparna i slutet för att flytta genom varje bild.

Specifikation för 347 rostfritt stålrör

347 12,7*1,24mm lindade rör i rostfritt stål

Ytterdiameter: 6,00 mm OD upp till 914,4 mm OD, storlekar upp till 24” OBS! tillgängligt i lager, OD-storlek Stålrör finns i lager

SS 347 Rörtjockleksområde: 0,3 mm – 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etc. (0,5-12 mm) Eller icke-vanlig storlek för att skräddarsys efter behov

Typ: SS 347 Seamless Pipes |SS 347 ERW Rör |SS 347 Svetsade rör |SS 347 Tillverkade rör |SS 347 CDW-rör, LSAW-rör / sömsvetsade / omdragna

Form: SS 347 runda rör/rör, SS 347 fyrkantiga rör/rör, SS 347 rektangulära rör/rör, SS 347 lindade rör, SS 347 "U" form, SS 347 Pan Cake Coils, SS 347 hydrauliska rör

Längd: Enkel slumpmässig, dubbel slumpmässig & erforderlig längd ände: slät ände, fasad ände, trampad ände

Ändskydd: Plastkapslar |Ytterfinish: 2B, No.4, No.1, No.8 Spegelfinish för rostfria stålrör, Finish enligt kundens krav

Leveransvillkor: glödgad och inlagd, polerad, ljusglödgad, kalldragen

Inspektion, testrapporter: Brukstestcertifikat, EN 10204 3.1, kemiska rapporter, mekaniska rapporter, PMI-testrapporter, visuella inspektionsrapporter, tredjepartsinspektionsrapporter, NABL-godkända labbrapporter, destruktiv testrapport, icke-förstörande testrapporter

Förpackning: Förpackad i trälådor, plastpåsar, stålremsor medföljande eller enligt kundens önskemål

Specialerbjudanden: Andra storlekar och specifikationer än ovan kan tillverkas på begäran

SS 347 rörstorleksområde: 1/2 tum OBS, OD till 24 tum

ASTM A312 347: Sömlöst och raksvetsat austenitiskt rör avsett för hög temperatur och allmänt korrosiv drift.Tillsatsmetall ej tillåtet vid svetsning.

ASTM A358 347: Elektriskt smältsvetsat austenitiskt rör för korrosiv och/eller högtemperaturservice.Normalt produceras endast rör upp till 8 tum enligt denna specifikation.Tillsats av tillsatsmetall är tillåten vid svetsning.

ASTM A790 347: Sömlöst och raksvetsat ferritiskt/austenitiskt (duplex) rör avsett för allmänt korrosivt arbete, med särskild tonvikt på motståndskraft mot spänningskorrosionssprickor.

ASTM A409 347: Rak- eller spiralsöm elektrisk smältsvetsad austenitisk lättväggsrör med stor diameter i storlekarna 14" till 30" med väggarna Sch5S och Sch 10S för korrosiva och/eller höga

ASTM A376 347: Sömlöst austenitiskt rör för högtemperaturapplikationer.

ASTM A813 347: Enkelsvetsade, enkel- eller dubbelsvetsade austenitiska rör för höga temperaturer och allmänna korrosiva applikationer.

ASTM A814 347: Kallbearbetade svetsade austenitiska rör för hög temperatur och allmän korrosiv service.

347H rostfria rör Kemisk sammansättning

Rostfritt stål 347H rör mekaniska egenskaper

Rostfritt stål 347H rör Fysiska egenskaper

Motsvarande kvaliteter för 347H rostfritt stålrör

Aggregering av amyloid alfa-synuklein (αS) är ett kännetecken för Parkinsons sjukdom och andra synukleinopatier.Nyligen har tau-proteinet som vanligtvis förknippas med Alzheimers sjukdom associerats med αS-patologi och funnits samlokaliseras i αS-rika inneslutningar, även om den molekylära mekanismen för samaggregation av de två proteinerna förblir oklar.Vi rapporterar här att αS-fasen separeras till flytande kondensat via elektrostatisk komplexkondensation med positivt laddade polypeptider som tau.Beroende på affiniteten hos αS för polykatjoner och graden av valensutarmning av koagulationsnätverket, genomgår koagel snabb gelning eller koalescens följt av långsam amyloidaggregation.Genom att kombinera en svit av avancerade biofysiska tekniker kunde vi karakterisera vätske-vätska αS/Tau fasseparation och identifiera nyckelfaktorerna som leder till bildandet av heterogena aggregat som innehåller båda proteinerna i ett flytande proteinkondensat.
Förutom membranavdelningar kan rumslig separation i celler också uppnås genom bildandet av proteinrika, vätskeliknande täta kroppar som kallas biomolekylära kondensat eller droppar, genom en process som kallas vätske-vätskefasseparation (LLPS).Dessa droppar bildas av multivalenta tidsinteraktioner, vanligtvis mellan proteiner eller proteiner och RNA, och tjänar en mängd olika funktioner i nästan alla levande system.Ett stort antal LLP-kapabla proteiner uppvisar sekvenser med låg komplexitet som är mycket oordnade till sin natur och i bildandet av biomolekylära kondensat3,4,5.Flera experimentella studier har avslöjat den flexibla, ofta oordnade och multivalenta naturen hos proteinerna som utgör dessa vätskeliknande kondensat, även om lite är känt om de specifika molekylära bestämningsfaktorerna som styr tillväxten och mognaden av dessa kondensat till ett mer fast-liknande kondensat. stat..
De nya data stöder hypotesen att avvikande proteindriven LLPS och omvandling av droppar till fasta strukturer kan vara relevanta cellulära vägar som leder till bildandet av olösliga toxiska aggregat som ofta är kännetecken för degenerativa sjukdomar.Många LLPS-associerade intrinsically disordered proteiner (IDPs), ofta mycket laddade och flexibla, har länge associerats med neurodegeneration genom processen för amyloidaggregation.Speciellt har biomolekylära IDP-kondensat som FUS7 eller TDP-438 eller proteiner med stora lågkomplexitetsdomäner som hnRNPA19 visat sig åldras till gelliknande eller till och med fasta former genom en process som kallas fluidisering.förening.till fastfasövergång (LSPT) som en funktion av tid eller som svar på vissa posttranslationella modifieringar eller patologiskt signifikanta mutationer1,7.
En annan IDP associerad med LLPS in vivo är Tau, ett mikrotubuli-associerat stört protein vars amyloidaggregering har varit inblandad i Alzheimers sjukdom10 men har också nyligen varit inblandad i Parkinsons sjukdom (PD) och andra synaptiska nukleära proteinopatier 11, 12, 13 är relaterade.Tau har visat sig spontant dissociera från lösning/cytoplasma på grund av gynnsamma elektrostatiska interaktioner14, vilket resulterar i bildandet av tau-berikade droppar kända som elektrostatiska koacervater.Det har också observerats att denna typ av ospecifik interaktion är drivkraften bakom många biomolekylära kondensat i naturen15.I fallet med ett tau-protein kan elektrostatisk aggregation bildas genom enkel aggregation, där motsatt laddade regioner av proteinet utlöser klyvningsprocessen, eller genom komplex aggregation genom interaktion med negativt laddade polymerer såsom RNA.
Nyligen har α-synuklein (αS), en amyloid IDP som är inblandad i PD och andra neurodegenerativa sjukdomar, gemensamt kända som synukleinopati17,18, visats i cellulära och djurmodeller19,20 koncentrerade i proteinkondensat med vätskeliknande beteende.In vitro-studier har visat att αS genomgår LLPS genom enkel aggregation genom övervägande hydrofoba interaktioner, även om denna process kräver exceptionellt höga proteinkoncentrationer och atypiskt långa inkubationstider19,21.Huruvida de αS-innehållande kondensat som observerats in vivo bildas av denna eller andra LLPS-processer förblir en viktig olöst fråga.På liknande sätt, även om αS-amyloidaggregation har observerats i neuroner i PD och andra synukleinopatier, förblir den exakta mekanismen genom vilken αS genomgår intracellulär amyloidaggregation oklart, eftersom överuttryck av detta protein inte verkar trigga denna process i sig.Ytterligare cellulär skada krävs ofta, vilket tyder på att vissa cellulära platser eller mikromiljöer krävs för återkämning av intracellulära αS-amyloidaggregat.En cellulär miljö som är särskilt utsatt för aggregation kan vara det inre av proteinkondensat 23 .
Intressant nog har αS och tau befunnits samlokaliseras i karaktäristiska sjukdomsinklusioner hos människor med Parkinsons sjukdom och andra synukleinopatier 24,25 och experiment har rapporterat ett synergistiskt patologiskt samband mellan de två proteinerna 26,27, vilket tyder på ett potentiellt samband mellan aggregation αS och tau vid neurodegenerativa sjukdomar.sjukdom.αS och tau har visat sig interagera och främja varandras aggregation in vitro och in vivo 28,29 och heterogena aggregat som består av dessa två proteiner har observerats i hjärnan hos patienter med synukleinopatier 30 .Lite är dock känt om den molekylära grunden för interaktionen mellan αS och tau och mekanismen för dess samaggregation.αS har rapporterats interagera med tau genom en elektrostatisk attraktion mellan den mycket negativt laddade C-terminala regionen av αS och den centrala prolinrika regionen av tau, som också är berikad med positivt laddade rester.
I denna studie visar vi att αS verkligen kan dissociera till droppar via elektrostatisk komplexkondensation i närvaro av tau-protein, i motsats till dess interaktion med andra positivt laddade polypeptider som poly-L-lysin (pLK), och i denna process.αS fungerar som en ställningsmolekyl för droppnätverket.Vi har identifierat märkbara skillnader i mognadsprocessen för elektrostatiska αS-koacervater, som är associerade med skillnader i valens och styrka hos interaktionen mellan proteiner som är involverade i koacervatnätverket.Intressant nog observerade vi samaggregation av αS- och tau-amyloidproteiner i långlivade vätskekoacervat och identifierade några nyckelfaktorer som leder till samaggregation av dessa två proteiner i sådana koacervat.Här beskriver vi i detalj denna process, som är en möjlig molekylär mekanism som ligger till grund för kolokaliseringen av två proteiner i sjukdomsspecifika inneslutningar.
αS har en mycket anjonisk C-terminal svans vid neutralt pH (Fig. 1a), och vi antog att den kunde genomgå LLPS genom kondensation av elektrostatiska komplex med polykatjoniska oordnade polypeptidmolekyler.Vi använde en 100-rester poly-L-lysin (pLK) som startmodellmolekyl på grund av dess positivt laddade och oordnade polymera natur vid neutralt pH 32. Först bekräftade vi att pLK interagerar med Ct-domänen av αS via Solution NMR-spektroskopi. (Figur 1b) med användning av 13C/15N-märkt αS i närvaro av ökande αS:pLK-molära förhållanden.Interaktionen av pLK med Ct-domänen av aS manifesterar sig i störningar av det kemiska skiftet och en minskning av toppintensiteten i denna region av proteinet.Intressant nog när vi blandade αS med pLK vid en αS-koncentration på ca.5–25 µM i närvaro av polyetylenglykol (5–15 % PEG-8) (typisk LLPS-buffert: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 15 % PEG-8) gick vi omedelbart igenom ett brett fält av proteinbildning .droppar observerades med användning av fluorescens (WF) och ljusfältsmikroskopi (BF) (Fig. 1c).1-5 µm droppar som innehåller koncentrerad αS (tillsatt 1 µM AlexaFluor488-märkt αS, AF488-αS), deras elektrostatiska egenskaper kan härledas från deras resistans mot 10 % 1,6-hexandiol (1,6-HD) och dess känslighet för en ökning av NaCl-koncentrationen (Fig. 1c).Den vätskeliknande naturen hos koacervaten i det elektrostatiska komplexet αS/pLK demonstreras av deras förmåga att smälta samman inom millisekunder (Fig. Id).Med hjälp av turbidimetri kvantifierade vi bildandet av droppar under dessa förhållanden, bekräftade den elektrostatiska karaktären hos den huvudsakliga interaktionen i samband med dess stabilitet (Fig. 1e), och utvärderade effekten av olika polymerförhållanden på LLPS-processen (Fig. 1f).Även om droppbildning observeras över ett brett spektrum av polymerförhållanden, är processen mycket fördelaktig när pLK överstiger αS.LLP:er har också observerats med användning av det kemiskt olika undanträngningsmedlet dextran-70 (70 kDa) eller med användning av en mängd olika provformat, inklusive glasskiva droppar, mikroplattor brunnar av olika material, Eppendorf eller kvarts kapillärer.
en schematisk representation av olika proteinregioner i WT-αS- och ΔCt-αS-varianterna som används i denna studie.Den amfipatiska N-terminala domänen, den hydrofoba amyloidbildande (NAC) regionen och den negativt laddade C-terminala domänen visas i blått, orange respektive rött.Kartan över WT-αS (Net Charge Per Residual) (NCPR) visas.b NMR-analys av aS/pLK-interaktionen i frånvaro av makromolekylära klumpar.När pLK-koncentrationen ökar (aS:pLK molförhållanden på 1:0,5, 1:1,5 och 1:10 visas i ljusgrönt, grönt respektive mörkgrönt).c Koacervat αS/pLK (molförhållande 1:10) vid 25 µM (1 µM AF488-märkt αS eller Atto647N-märkt pLK för WF-avbildning) i LLPS-buffert (överst) eller kompletterat med 500 mM NaCl (nederst till vänster) eller efter 10 % 1,6-hexandiol (1,6-HD; nedre höger).Skalstång = 20 µm.d Representativa mikroskopiska bilder av BF-droppfusion av αS/pLK (molförhållande 1:10) vid en koncentration av 25 μM;pilar indikerar sammanslagning av enskilda droppar (röda och gula pilar) till en ny droppe (orange pil) inom 200 ms).Skalstång = 20 µm.e Ljusspridning (vid 350 nm) αS/pLK-aggregation i LLPS-buffert före och efter tillsats av 500 mM NaCl eller 10 % 1,6-HD vid 25 µM αS (N = 3 provreplikat, medelvärde och standardavvikelse anges också).f BF-bild (överst) och ljusspridningsanalys (vid 350 nm, botten) av αS/pLK-aggregation vid 25 μM αS med ökande αS:pLK-molförhållande (N = 3 provreplikat, medelvärde och standardavvikelse anges också).Skalstång = 10 µm.Skalfältet på en bild indikerar skalan för alla bilder i en panel.Rådata tillhandahålls i form av rådatafiler.
Baserat på våra observationer av αS/pLK elektrostatisk komplexkondensation och tidigare observationer av αS som en klientmolekyl av tau/RNA-kondensatet genom direkt interaktion med tau31, antog vi att αS och tau kunde samsegregera med lösningsmedlet i frånvaro av RNA kondensation.genom elektrostatiska komplex, och αS är ställningsproteinet i αS/Tau-koacervat (se tau-laddningsfördelning i figur 2e).Vi observerade att när 10 μM αS och 10 μM Tau441 (innehållande 1 μM AF488-αS respektive 1 μM Atto647N-Tau) blandades ihop i LLPS-buffert, bildade de lätt proteinaggregat innehållande båda proteinerna, som sett med WF-mikroskopi.(Fig. 2a).Kolokaliseringen av de två proteinerna i dropparna bekräftades med konfokal (CF) mikroskopi (kompletterande fig. la).Liknande beteende observerades när dextran-70 användes som ett aggregationsmedel (kompletterande fig. le).Genom att använda antingen FITC-märkt PEG eller dextran fann vi att båda trängningsmedlen var jämnt fördelade över proverna, vilket varken visade segregation eller association (kompletterande fig. 1d).Snarare antyder det att de i detta system främjar fasseparation genom makromolekylära trängningseffekter, eftersom PEG är ett preferentiellt stabilt trängningsmedel, vilket ses i andra LLP-system33,34.Dessa proteinrika droppar var känsliga för NaCl (1 M) men inte för 1,6-HD (10 % v/v), vilket bekräftar deras elektrostatiska egenskaper (kompletterande figur 2a, b).Deras vätskebeteende bekräftades genom att observera millisekunders sammanslagna dropphändelser med hjälp av BF-mikroskopi (Fig. 2b).
en konfokal (CF) mikroskopibilder av αS/Tau441-koacervater i LLPS-buffert (10 μM av varje protein, 0,5 μM AF488-märkt αS och Atto647N-märkt Tau441).b Representativa bilder av differentiell interferenskontrast (DIC) av αS/Tau441 droppfusionshändelser (10 μM för varje protein).c Fasdiagram baserat på ljusspridning (vid 350 nm) av Tau441 LLPS (0–15 µM) i frånvaro (vänster) eller närvaro (höger) av 50 µM αS.Varmare färger indikerar mer spridning.d Ljusspridning av αS/Tau441 LLPS-prover med ökande αS-koncentration (Tau441 vid 5 µM, N = 2–3 provupprepningar enligt indikation).e Schematisk representation av några tau-proteinvarianter och olika regioner av proteinet som används i denna studie: negativt laddad N-terminal domän (röd), prolinrik region (blå), mikrotubulibindande domän (MTBD, markerad i orange) och amyloidbildande parspiral.filamentregioner (PHF) belägna inom MTBD (grå).Kartan över NCPR (Net Charge Per Residue) över Tau441 visas.f Användning av 1 µM AF488-märkt αS och Atto647N-märkt ΔNt-, med användning av 1 µM AF488-märkt αS eller ΔCt-αS i närvaro av ΔNt-Tau (överst, 10 µM per protein) eller µM protein per 58 (botten) ) ) ) mikrofotografier av WF kondenserad i LLPS- eller K18-buffert.Skalstaplarna i en bild representerar skalan för alla bilder i en panel (20 µm för panelerna a, b och f).Rådata för panelerna c och d tillhandahålls som rådatafiler.
För att testa rollen av αS i denna LLPS-process, undersökte vi först effekten av αS på droppstabilitet genom nefelometri med ökande koncentrationer av NaCl (Fig. 2c).Ju högre saltkoncentration i proven som innehåller αS, desto högre ljusspridningsvärden (vid 350 nm), vilket indikerar den stabiliserande rollen för αS i detta LLPS-system.En liknande effekt kan observeras genom att öka αS-koncentrationen (och därmed αS:Tau441-förhållandet) till ca.10-faldig ökning i förhållande till tau-koncentrationen (5 µM) (Fig. 2d).För att visa att αS är ett ställningsprotein i koacervat, bestämde vi oss för att undersöka beteendet hos den LLPS-avbrutna Tau-mutanten, som saknar en negativt laddad N-terminal region (rester 1–150, se fig. 2e) som kallas ΔNt-Tau.WF-mikroskopi och nefelometri bekräftade att ΔNt-Tau själv inte genomgick LLPS (fig. 2f och kompletterande fig. 2d), som tidigare rapporterats 14. Men när αS tillsattes till dispersionslösningar av denna trunkerade Tau-variant, var LLPS-processen fullständigt återställd med droppdensitet nära dropptätheten för fullstorlekslösningar av Tau och αS under liknande förhållanden och proteinkoncentrationer.Denna process kan också observeras under förhållanden med låg makromolekylär trängsel (kompletterande fig. 2c).Rollen för den C-terminala αS-regionen, men inte hela dess längd, i LLPS-processen visades genom hämning av droppbildning med användning av en C-terminal trunkerad αS-variant som saknar resterna 104–140 (Fig. 1a) av (ΔCt- aS)-protein (fig. 2f och kompletterande fig. 2d).Kolokaliseringen av αS och ΔNt-Tau bekräftades med konfokal fluorescensmikroskopi (kompletterande fig. 1b).
För att ytterligare testa LLPS-mekanismen mellan Tau441 och αS användes en ytterligare Tau-variant, nämligen det parade spiralformade filamentkärnan (PHF)-fragmentet i den mikrotubulibindande domänen (MTBD), som om den innehåller fyra karakteristiska upprepade domäner, allmänt också kända som K18-fragmentet (se fig. 2e).Det har nyligen rapporterats att aS företrädesvis binder till ett tau-protein beläget i en prolinrik domän i en sekvens som föregår den mikrotubulibindande domänen.Men PHF-regionen är också rik på positivt laddade rester (se figur 2e), särskilt lysin (15 % rester), vilket fick oss att testa om denna region också bidrar till kondensationen av αS/Tau-komplexet.Vi observerade att K18 enbart inte kunde utlösa LLPS vid koncentrationer upp till 100 μM under de testade förhållandena (LLPS-buffert med 15% PEG eller 20% dextran) (Figur 2f).Men när vi tillsatte 50 µM αS till 50 µM K18, observerades snabb bildning av proteindroppar innehållande K18 och αS genom nefelometri (kompletterande Fig. 2d) och WF-mikroskopi (Fig. 2f).Som väntat kunde ΔCt-aS inte återställa LLPS-beteendet hos K18 (Fig. 2f).Vi noterar att αS/K18-aggregation kräver något högre proteinkoncentrationer för att inducera LLPS jämfört med αS/ΔNt-Tau eller αS/Tau441, allt annat lika.Detta överensstämmer med en starkare interaktion av den αS C-terminala regionen med den prolinrika Tau-domänen jämfört med den mikrotubulibindande domänen, som beskrivits tidigare 31 .
Med tanke på att ΔNt-Tau inte kan utföra LLPS i frånvaro av αS, valde vi denna Tau-variant som en modell för att karakterisera αS/Tau LLPS med tanke på dess enkelhet i LLPS-system med fullängds Tau (isotyp, Tau441/Tau441).med komplexa (heterotypiska, αS/Tau441) aggregeringsprocesser.Vi jämförde graden av αS-aggregation (som en del av det kondenserade fasproteinet, fαS,c) i αS/Tau- och αS/ΔNt-Tau-systemen genom centrifugering och dispergerad fas SDS-PAGE-analys (se 2e), fann mycket liknande värden för alla proteiner i samma koncentration.I synnerhet erhöll vi fαS,c 84 ± 2% och 79 ± 7% för αS/Tau respektive αS/ΔNt-Tau, vilket tyder på att den heterotypiska interaktionen mellan αS och tau är överlägsen interaktionen mellan tau-molekyler.mellan.
Interaktionen med olika polykatjoner och effekten av kondensationsprocessen på αS-kinetiken studerades först med metoden fluorescensåtervinning efter fotoblekning (FRAP).Vi testade αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau och αS/pLK koacervat (100 μM αS kompletterat med 2 μM αS AF488-αS och 100 μM Tau441 eller ΔNt-Tau eller 1 mM pLK).Data erhölls inom de första 30 minuterna efter blandning av provkomponenterna.Från representativa FRAP-bilder (fig. 3a, αS/Tau441-kondensation) och deras motsvarande tidsförloppskurvor (fig. 3b, kompletterande fig. 3), kan det ses att αS-kinetiken är mycket lik den för Tau441-koacervater.och ΔNt-Tau, som är mycket snabbare med pLK.De beräknade diffusionskoefficienterna för αS inuti koacervatet enligt FRAP (som beskrivits av Kang et al. 35) är D = 0,013 ± 0,009 µm2/s och D = 0,026 ± 0,008 µm2/s för αS/TauS/Δ för αS/TauS/Δ αS/-systemet.pLK, Tau och D = 0,18 ± 0,04 µm2/s respektive (fig. 3c).Emellertid är diffusionskoefficienten αS i den dispergerade fasen flera storleksordningar högre än alla kondenserade faser, vilket bestäms av fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS, se tilläggsbild 3) under samma förhållanden (LLPS-buffert) men i frånvaro av polykatjoner (D = 8 ± 4 µm2/s).Därför är kinetiken för αS-translation signifikant reducerad i koacervat jämfört med proteiner i den dispergerade fasen på grund av uttalade molekylära trängningseffekter, även om alla koacervat behåller vätskeliknande egenskaper under den första halvtimmen efter bildandet, i motsats till tau-fasen.snabbare kinetik i pLK-kondensat.
a–c FRAP-analys av αS-dynamik (2 % AF488-märkt αS) i elektrostatiska koacervat.Representativa bilder av αS/Tau441 FRAP-analyser i tre exemplar visas i (a), där röda cirklar indikerar avfärgade områden.Skalstången är 5 µm.b Genomsnittliga FRAP-kurvor och (c) beräknade diffusionskoefficienter (D) för 5–6 (N) olika droppar från tre experiment med 100 µM αS och ekvimolära koncentrationer av Tau441 (röd) eller ΔNt-Tau (blå) eller pLK (grön) vid tio gånger koncentrationen av LLPS.Standardavvikelsen för FRAP-kurvan visas i skuggad färg.Som jämförelse bestämdes diffusionskoefficienten αS i den dispergerade fasen i tre exemplar med användning av fluorescenskorrelationsspektroskopi (FCS) (se tilläggsfigur 3 och metoder för mer information).d Kontinuerliga X-bands EPR-spektra av 100 μM TEMPOL-122-αS i LLPS-buffert utan någon polykatjon (svart) eller i närvaro av 100 μM Tau441 (röd) eller ΔNt-Tau (blå) eller 1 mM pLK (grön).Insatsen visar en förstorad bild av de starka fältlinjerna där de mest dramatiska förändringarna inträffar.e Bindningskurvor på 50 μM TEMPOL-122-αS med olika polykatjoner i frånvaro av LLPS (ingen PEG).Den reducerade amplituden för band III jämfört med band II (IIII/III) av det normaliserade EPR-spektrumet har visat sig öka molförhållandena för Tau441 (röd), ΔNt-Tau (blå) och pLK (grön).Färgade linjer visar passform till data med hjälp av en grov bindningsmodell med n identiska och oberoende bindningsställen på varje kurva.Rådata tillhandahålls i form av rådatafiler.
Som ett komplement undersökte vi dynamiken hos αS i olika koacervat med hjälp av riktad spin-märkning (SDSL) och kontinuerlig elektronparamagnetisk resonans (CW-EPR).Denna metod har visat sig vara mycket användbar för att rapportera flexibiliteten och dynamiken hos IDP med en realistisk restupplösning36,37,38.För detta ändamål konstruerade vi cysteinrester i enstaka Cys-mutanter och använde 4-hydroxi-2,2,6,6-tetrametylpiperidin-N-oxyl (TEMPOL) spinproben.Maleimidderivat märker dem.Mer specifikt infogade vi TEMPOL-sonder i position 122 eller 24 αS (TEMPOL-122-αS och TEMPOL-24-αS).I det första fallet riktar vi oss mot den C-terminala regionen av proteinet, som är involverad i interaktion med polykatjoner.Istället kan position 24 ge oss information om den övergripande dynamiken hos proteinerna i kondensatet.I båda fallen motsvarade EPR-signalerna som erhölls för proteiner i den dispergerade fasen nitroxidradikaler i det snabbrörliga tillståndet.Efter fasseparation i närvaro av tau eller pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 eller ΔNt-Tau i förhållandet 1:1 eller pLK i förhållandet 1:10), observerades en ökning av den relativa toppintensiteten i EPR-spektrumet för αS.Förlustlinjen breddades, vilket indikerar minskad αS-omorienteringskinetik i droppar jämfört med protein i utspädd fas (fig. 3d, kompletterande fig. 4a).Dessa förändringar är mer uttalade vid position 122. Medan närvaron av pLK i position 24 inte påverkade probens kinetik, ändrades vid position 122 den spektrala linjeformen signifikant (kompletterande fig. 4a).När vi försökte modellera spektra vid position 122 av två αS/polykatjonsystem med hjälp av den isotropiska modellen (kompletterande figur 5a) som vanligtvis används för att beskriva dynamiken hos spin-märkt IDP38,39, kunde vi inte rekonstruera de experimentella spektra..Spektral simulering av positionen för 24 spins kontraster (kompletterande fig. 5a).Detta tyder på att det finns föredragna positioner i utrymmet för spinnkonfigurationer av den C-terminala regionen av aS i närvaro av polykatjoner.När man överväger fraktionen av αS i den kondenserade fasen under experimentella EPR-förhållanden (84 ± 2 %, 79 ± 7 % och 47 ± 4 % för αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau respektive αS/pLK – se tillägg Fig. 2e i dataanalys c), kan det ses att breddningen som detekteras med EPR-metoden huvudsakligen återspeglar interaktionen av den C-terminala regionen av αS med olika polykatjoner i den kondenserade fasen (den huvudsakliga förändringen vid användning av TEMPOL-122- αS), och inte proteinkondensation.En ökning av mikroviskositeten observeras i sonden.Som förväntat återställdes EPR-spektrumet för proteinet under andra betingelser än LLPS fullständigt när 1 M NaCl tillsattes till blandningen (kompletterande fig. 4b).Sammantaget tyder våra data på att förändringarna som detekteras av CW-EPR huvudsakligen återspeglar interaktionen av den C-terminala regionen av αS med olika polykatjoner i den kondenserade fasen, och denna interaktion verkar vara starkare med pLK än med Tau.
För att få mer strukturell information om proteinerna i koacervatet bestämde vi oss för att studera LLPS-systemet med hjälp av NMR i lösning.Vi kunde dock bara detektera αS-fraktionen som finns kvar i den dispergerade fasen, vilket kan bero på minskad proteindynamik inuti koacervatet och en tät fas i botten av lösningen i NMR-analys.När vi analyserade strukturen och dynamiken hos proteinet som var kvar i den dispergerade fasen av LLPS-provet med hjälp av NMR (kompletterande figur 5c, d), märkte vi att proteinet uppförde sig nästan identiskt i närvaro av pLK och ΔNt-Tau, båda av som var i sekundär struktur och dynamik hos proteinryggraden, avslöjade genom experiment på sekundärt kemiskt skift och R1ρ-relaxation.NMR-data visar att C-terminalen av aS lider av en signifikant förlust av konformationell flexibilitet samtidigt som den behåller sin oordnade natur, liksom resten av proteinsekvensen, på grund av dess interaktioner med polykatjoner.
Eftersom CW-EPR-signalbreddningen som observerades i den kondenserade TEMPOL-122-αS-fasen återspeglar interaktionen mellan proteinet och polykatjoner, utförde vi en EPR-titrering för att utvärdera bindningsaffiniteten för αS till olika polykatjoner i frånvaro av LLPS (ingen ackumulering av Buffer LLPS), vilket tyder på att interaktionerna är desamma i utspädda och koncentrerade faser (vilket bekräftas av våra data, tilläggsbild 4a och tilläggsbild 6).Målet var att se om alla koacervat, trots sina gemensamma vätskeliknande egenskaper, uppvisar något underliggande differentiellt beteende på molekylär nivå.Som väntat breddades EPR-spektrumet med ökande polykatjonkoncentration, vilket återspeglar en minskning av molekylär flexibilitet på grund av molekylära interaktioner mellan alla interaktionspartners nästan till mättnad (Fig. 3e, Tilläggsbild 6).pLK uppnådde denna mättnad vid ett lägre molförhållande (polykatjon:αS) jämfört med ΔNt-Tau och Tau441.Faktum är att jämförelse av data med en ungefärlig bindningsmodell som antar n identiska och oberoende bindningsställen visade att den skenbara dissociationskonstanten för pLK (~5 μM) är en storleksordning lägre än den för Tau441 eller ΔNt-Tau (~50 μM) ).µM).Även om detta är en grov uppskattning, tyder detta på att αS har en högre affinitet för enklare polykatjoner med kontinuerliga positiva laddningsregioner.Med tanke på denna skillnad i affinitet mellan αS och olika polykatjoner, antog vi att deras flytande egenskaper kan förändras olika över tiden och därmed lida av olika LSPT-processer.
Med tanke på den mycket trånga miljön inom proteinkoacervatet och proteinets amyloida natur, observerade vi beteendet hos koacervatet över tid för att upptäcka möjliga LSPT-processer.Med hjälp av BF- och CF-mikroskopi (Figur 4) observerade vi att αS/Tau441 koacerverar i stor utsträckning i lösning och bildar stora droppar som kommer i kontakt med och väter ytan i botten av brunnen/sliden som fulla droppar, som förväntat (tilläggsbild). 7d);vi kallar dessa bottenformade strukturer för "proteinflottar".Dessa strukturer förblev flytande eftersom de bibehöll förmågan att smälta samman (kompletterande fig. 7b) och kunde ses i flera timmar efter att LLPS utlöstes (fig. 4 och kompletterande fig. 7c).Vi observerade att vätningsprocessen gynnas på ytan av hydrofila snarare än hydrofoba material (kompletterande fig. 7a), som förväntat för elektrostatiska koacervat med obalanserade laddningar och därmed höga elektrostatiska ytpotentialer.Noterbart reducerades αS/ΔNt-Tau-koalescens och forsränning signifikant, medan αS/pLK-kondensat reducerades signifikant (Fig. 4).Under den korta inkubationstiden kunde αS/pLK-dropparna koalescera och väta den hydrofila ytan, men denna process avbröts snabbt och efter 5 timmars inkubation observerades endast begränsade koalescenshändelser och ingen vätning.– gel-dropp övergång.
Representativa BF (gråskalepaneler) och CF (höger paneler, AF488-märkt αS i grönt) av koacervatprover innehållande 100 µM αS (1 % fluorescerande etikett) i LLPS-buffert i närvaro av 100 µM Tau441 (överst) fluorescensbilder ΔN -Tau (mitten) eller 1 mM pLK (botten) vid olika inkubationstider och fokalhöjder (z, avstånd från botten av plattbrunnen).Experimenten upprepades 4-6 gånger oberoende av varandra med samma resultat.αS/Tau441-koacervat vätas efter 24 timmar och bildar flottar som är större än bilden.Skalstapeln för alla bilder är 20 µm.
Vi frågade sedan om de stora vätskeliknande proteinpoolerna som bildas i αS/Tau441 LLPS skulle leda till amyloidaggregering av något av de studerade proteinerna.Vi följde mognaden av αS/Tau441-droppar över tiden med WF-mikroskopi under samma förhållanden som ovan, men med 1 μM AF488-märkt αS och Atto647N-märkt Tau441 (Fig. 5a).Som förväntat observerade vi fullständig proteinlokalisering under hela mognadsprocessen.Intressant nog, från ca.Efter 5 timmar observerades mer intensiva icke-cirkulära strukturer inuti flottarna, som vi kallade "punkter", av vilka några var samlokaliserade med αS, och några berikades med Tau441 (Fig. 5a, vita pilar).Dessa fläckar har alltid observerats inom flottar i större utsträckning för αS/ΔNt-Tau än för αS/ΔNt-Tau.Det fanns inga distinkta fläckar i dropparna i pLK- och Tau-system som var inkompetenta för fusion/vätning.För att testa om dessa fläckar som innehåller αS och Tau441 är amyloidliknande aggregat utförde vi ett liknande experiment med CF-mikroskopi där Tau441 märktes med Atto647N och 12,5 μM amyloidspecifik tioflavin-T (ThT) tillsattes från början.färga.Även om ThT-färgning av αS/Tau441-droppar eller -flottar inte observerades ens efter 24 timmars inkubation (Fig. 5b, översta raden - kvarvarande droppar över proteinflottar), var ThT-positiva strukturer innehållande Atto647N-Tau441 inuti flottarna mycket svaga.detta replikerar storleken, formen och placeringen av de tidigare beskrivna fläckarna (fig. 5b, mitten och nedre rader), vilket tyder på att fläckarna kan motsvara amyloidliknande aggregat som bildas i åldrande vätskekoacervat.
WF 25 μM αS vid olika inkubationstider och fokalhöjder (z, avstånd från obunden botten) i närvaro av 25 μM Tau441 (1 μM AF488-märkt αS och Atto647N-märkt Tau441) i en brunn i en mikroskopplatta med LLPS-buffert) .Sex experiment upprepades oberoende av varandra med liknande resultat.b CF mikroskopisk bild av 25 μM αS i närvaro av 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N-märkt Tau441) och 12,5 μM tioflavin-T (ThT).Viktade proteindroppar och deponerade proteinflottar och fläckar visas i de övre respektive mellersta raden.Den nedre raden visar bilder av flottar och droppar från 3 oberoende replikat.Vita pilar indikerar ThT-positiva prickar i båda panelerna.Skalstapeln för alla bilder är 20 µm.
För att undersöka mer i detalj förändringarna i koacervatproteinnätverket under övergången från flytande till fast, använde vi fluorescenslivstidsavbildning (FLIM) och Förster resonansenergiöverföringsmikroskopi (FRET) (figur 6 och kompletterande figurer 8 och 9).Vi antog att skiktets koacervatmognad till en mer kondenserad eller till och med fast-liknande aggregerad proteinstruktur leder till närmare kontakt mellan proteinet och den fluorescerande sonden som är fäst vid den, vilket potentiellt ger en släckningseffekt som manifesteras i en förkortad sondlivslängd (τ) , som beskrivits tidigare40.,41,42.Dessutom, för dubbelmärkta prover (AF488 och Atto647N som FRET-donator- respektive acceptorfärgämnen), kan denna minskning av τ också åtföljas av koacervatkondensation och en ökning av FRET(E)-effektiviteten under LSPT.Vi övervakade flott- och fläckbildning över tiden i LLPS αS/Tau441- och αS/ΔNt-Tau-prover (25 µM av varje protein i LLPS-buffert innehållande 1 µM AF488-märkt αS och/eller Atto647N-märkt Tau441 eller ΔNt-Tau).Vi observerade en allmän trend i att fluorescenslivslängden för AF488 (τ488) och Atto647N (τ647N) proberna minskade något när koacervaten mognade (fig. 6 och kompletterande fig. 8c).Intressant nog förbättrades denna förändring avsevärt för prickar inom flottar (Fig. 6c), vilket indikerar att ytterligare proteinkondensering inträffade vid prickar.Till stöd för detta observerades ingen signifikant förändring i fluorescenslivslängd för αS/ΔNt-Tau-droppar som åldrats i 24 timmar (kompletterande fig. 8d), vilket tyder på att droppgelning är en process som skiljer sig från fläckbildning och som inte åtföljs av betydande molekylär omorganisation inom koacervat.Det bör noteras att prickarna har olika storlekar och varierande innehåll i αS, speciellt för αS/Tau441-systemet (tilläggsbild 8e).Minskningen i punktfluorescenslivslängd åtföljdes av en ökning i intensitet, särskilt för Atto647N-märkt Tau441 (kompletterande fig. 8a), och högre FRET-effektiviteter för både αS/Tau441- och αS/ΔNt-Tau-system, vilket indikerar ytterligare kondensation i LLPS Fem timmar efter utlösning kondenserades proteinerna inuti den statiska elektriciteten.Jämfört med αS/ΔNt-Tau observerade vi lägre τ647N och något högre τ488-värden i αS/Tau441-fläckar, tillsammans med lägre och mer inhomogena FRET-värden.Möjligen kan detta vara relaterat till det faktum att i αS/Tau441-systemet är den observerade och förväntade αS-förekomsten i aggregat mer heterogen, ofta substökiometrisk jämfört med Tau, eftersom Tau441 i sig också kan genomgå LLPS och aggregering (Supplerande Fig. 8e) .Graden av droppkoalescens, flottbildning och, viktigare, proteinaggregation inom vätskeliknande koacervat är dock maximal när både Tau441 och αS är närvarande.
en livstidsfluorescensmikroskopi (FLIM) bilder av αS/Tau441 och αS/ΔNt-Tau vid 25 μM av varje protein (1 μM AF488-märkt αS och 1 μM Atto647N-märkt Tau441 eller ΔNt-PSTau) i ΔNt-LLPSTau.Kolumnerna visar representativa bilder av LLPS-prover vid olika mognadstider (30 min, 5 timmar och 24 timmar).Den röda ramen visar regionen som innehåller αS/Tau441-fläckar.Livslängder visas som färgstaplar.Skalstapel = 20 µm för alla bilder.b Inzoomad FLIM-bild av det valda området, som visas i den röda rutan i panel a.Livslängder visas med samma färgskala som i panel a.Skalstång = 5 µm.c Histogram som visar AF488 (fäst till αS) eller Atto647N (fäst till Tau) för olika proteinarter (droppar-D-, raft-R- och speckle-P) identifierade i FLIM-bilder inspelade för αS-) timingdistributioner livslängd för Tau441 och αS/ΔNt-Tau-koacervatprover (N = 17-32 ROI för D, 29-44 ROI för R och 21-51 ROI för poäng).Medel- och medianvärden visas som gula rutor respektive svarta linjer inuti rutor.De nedre och övre gränserna för rutan representerar den första respektive tredje kvartilen, och minimi- och maximivärdena inom det 1,5-faldiga interkvartilintervallet (IQR) visas som morrhår.Outliers visas som svarta diamanter.Statistisk signifikans mellan par av distributioner bestämdes med hjälp av ett två-prov t-test, med antagande av ojämna varianser.Tvåsidiga t-test p-värden visas med asterisker för varje par av jämförda data (* p-värde > 0,01, ** p-värde > 0,001, *** p-värde > 0,0001, **** p-värde > 0,00001), ns Indikerar försumbarhet (p-värde > 0,05).De exakta p-värdena anges i tilläggstabell 1, och originaldata presenteras som rådatafiler.
För att ytterligare demonstrera den amyloidliknande naturen hos fläckar/aggregat, behandlade vi ofärgade koacervatprover i 24 timmar med höga koncentrationer av (1 M) NaCl, vilket resulterade i separation av aggregat från proteinkoacervat.När isolerade aggregat (dvs. en dispergerad lösning av aggregat) observerades med hjälp av atomkraftsmikroskopi (AFM), observerade vi en övervägande sfärisk morfologi med en regelbunden höjd på cirka 15 nm, som tenderar att associeras under förhållanden med hög saltkoncentration, liknande beteendet hos typiska amyloidfibriller på grund av den starka hydrofoba effekten på ytan (observera att fibriller vanligtvis har en höjd av ~10 nm) (kompletterande fig. 10a).Intressant nog, när isolerade aggregat inkuberades med ThT i en standard ThT-fluorescensanalys, observerade vi en dramatisk ökning av ThT-fluorescenskvantutbytet, jämförbar med den som observerades när färgämnet inkuberades med typiska αS-amyloidfibriller (tilläggsbild 10b), vilket tyder på att koacervataggregaten innehåller amyloidliknande strukturer..I själva verket var aggregaten toleranta mot höga saltkoncentrationer men känsliga för 4 M guanidinklorid (GdnHCl), som typiska amyloidfibriller (kompletterande fig. 10c).
Därefter analyserade vi sammansättningen av aggregaten med användning av enkelmolekylär fluorescens, specifik fluorescenskorrelation/korskorrelationsspektroskopi (FCS/FCCS) och burstanalys av tvåfärgssammanfallsdetektion (TCCD).För detta ändamål isolerade vi aggregat bildade efter 24 timmars inkubation i 100 μl LLPS-prover innehållande αS och Tau441 (båda 25 μM) tillsammans med 1 μM AF488-märkt αS och 1 μM Atto647N-märkt Tau4411.Späd den resulterande dispergerade aggregatlösningen till ett monomolekylärt tillstånd med samma PEG-fria buffert och 1 M NaCl (samma buffert som används för att separera aggregat från koacervat) för att förhindra eventuella elektrostatiska interaktioner mellan LLPS och protein.Ett exempel på tidsbanan för en enskild molekyl kan ses i fig. 7a.FCCS/FCS-analys (korskorrelation, CC och autokorrelation, AC) visade att aggregat innehållande αS och tau fanns rikligt i proverna (se CC-kurvan i fig. 7b, vänster panel), och ett överskott av kvarvarande monomert protein uppstod som en resultatet av utspädningsprocessen (se AC-kurvor i figur 7b, vänster panel).Kontrollexperiment utförda under samma lösningsförhållanden med prover innehållande endast monomera proteiner visade inga CC-kurvor, och AC-kurvorna passade väl med enkomponentdiffusionsmodellen (Ekv. 4), där monomera proteiner har de förväntade diffusionskoefficienterna (Fig. 7b) ), höger panel).Diffusionskoefficienten för aggregerade partiklar är mindre än 1 µm2/s, och den för monomera proteiner är cirka 1 µm2/s.50–100 µm/s;värden liknar tidigare publicerade värden för sonikerad αS amyloidfibriller och monomer αS separat under liknande lösningsförhållanden44.När vi analyserade aggregaten med TCCD-explosionsanalys (fig. 7c, övre panelen), fann vi att i varje isolerat aggregat (αS/Tau-heteroaggregat) innehöll cirka 60 % av de detekterade aggregaten både αS och tau, cirka 30 % innehöll endast tau, endast cirka 10 % aS.Stökiometrisk analys av αS/Tau-heteroaggregat visade att de flesta heteroaggregaten var anrikade på tau (stökiometri under 0,5, det genomsnittliga antalet tau-molekyler per aggregat är 4 gånger fler än αS-molekyler), vilket är i linje med vårt arbete som observerats i FLIM in situ experiment..FRET-analys visade att dessa aggregat innehöll båda proteinerna, även om de faktiska FRET-värdena i detta fall inte är av stor betydelse, eftersom fördelningen av fluoroforer i varje aggregat var slumpmässig på grund av ett överskott av omärkt protein som användes i experimentet.Intressant nog, när vi utförde samma analys med användning av den 45,46 mogna amyloidaggregationsbristande Tau-varianten (se tilläggsbild 11a,b), märkte vi att även om den elektrostatiska aS-aggregationen var densamma (tilläggsbild 11c, d), förmågan att bilda aggregat inom koacervatet reducerades drastiskt och FLIM upptäckte flera fläckar i in situ-experiment, och svaga korskorrelationskurvor observerades för isolerade aggregatprover.Men för ett litet antal detekterade aggregat (endast en tiondel av Tau441), observerade vi att varje aggregat var berikat med αS än denna Tau-variant, med ungefär 50 % av de detekterade aggregaten som endast innehöll αS-molekyler, och αS var heterogent i överskott .aggregat (se kompletterande fig. 11e), i motsats till de heterogena aggregaten som genereras av Tau441 (fig. 6f).Resultaten av dessa experiment visade att även om αS själv kan ackumuleras med tau i koacervatet, är tau-kärnbildning mer gynnsam under dessa förhållanden, och de resulterande amyloidliknande aggregaten kan fungera som en form av αS och tau.Emellertid, när en tau-rik kärna har bildats, gynnas heterotypiska interaktioner mellan αS och tau i aggregat framför homotypa interaktioner mellan tau-molekyler;vi observerar också proteinnätverk i flytande αS/tau-koacervat.
a Representativa fluorescerande temporala spår av enstaka molekyler av isolerade aggregat bildade i αS/Tau441 elektrostatiska koacervat.Bursts motsvarande αS/Tau441-samaggregat (skurar över det angivna tröskelvärdet) observerades i tre detektionskanaler (AF488 och Atto647N emission efter direkt excitation, blå och röda linjer, Atto647N emission efter indirekt excitation), FRET, violett linje).b FCS/FCCS-analys av ett prov av isolerade αS/Tau441-aggregat erhållna från LLPS (vänster panel).Autokorrelationskurvor (AC) för AF488 och Atto647N visas i blått respektive rött, och korskorrelationskurvor (CC) associerade med aggregat som innehåller båda färgämnena visas i lila.AC-kurvorna återspeglar närvaron av märkta monomera och aggregerade proteinarter, medan CC-kurvorna endast visar diffusionen av dubbelmärkta aggregat.Samma analys, men under samma lösningsförhållanden som i isolerade fläckar, prover som endast innehåller monomert αS och Tau441 visas som kontroller i den högra panelen.c Fluorescensblixtanalys av enstaka molekyler av isolerade aggregat bildade i αS/Tau441 elektrostatiska koacervat.Information för varje aggregat som finns i fyra olika upprepningar (N = 152) plottas mot deras stökiometri, S-värden och FRET-effektivitet (översta panelen, färgfältet reflekterar förekomsten).Tre typer av aggregat kan särskiljas: -αS-bara aggregat med S~1 och FRET~0, Tau-bara aggregat med S~0 och FRET~1, och heterogena Tau/αS-aggregat med mellanliggande S och FRET Uppskattningar av mängden av båda markörproteinerna som detekteras i varje heterogent aggregat (N = 100) visas i den nedre panelen (färgskalan återspeglar förekomsten).Rådata tillhandahålls i form av rådatafiler.
Mognad eller åldring av flytande proteinkondensat till gelliknande eller fasta strukturer med tiden har rapporterats vara involverad i flera fysiologiska funktioner hos kondensatet47 såväl som i sjukdom, som en onormal process som föregår amyloidaggregation 7, 48, 49. Här vi studerar fasseparation och beteende i detalj.LSPT αS i närvaro av slumpmässiga polykatjoner i en kontrollerad miljö vid låga mikromolära koncentrationer och fysiologiskt relevanta förhållanden (observera att den beräknade fysiologiska koncentrationen av αS är >1 µM50), efter typiska termodynamiskt drivna beteenden hos LPS.Vi fann att αS, som innehåller en starkt negativt laddad C-terminal region vid fysiologiskt pH, kan bilda proteinrika droppar i vattenlösning via LLPS i närvaro av starkt katjoniska störda peptider såsom pLK eller Tau genom elektrostatisk process. komplex kondensation i närvaro av aggregationsmakromolekyler.Denna process kan ha relevanta effekter i den cellulära miljön där αS möter olika polykatjoniska molekyler associerade med dess sjukdomsassocierade aggregation både in vitro och in vivo51,52,53,54.
I många studier har proteindynamik i droppar ansetts vara en av nyckelfaktorerna som bestämmer mognadsprocessen55,56.I elektrostatiska αS-koacervater med polykatjoner beror mognadsprocessen tydligen på styrkan hos interaktioner med polykatjoner, valensen och mångfalden av dessa interaktioner.Jämviktsteorin antyder att ett jämviktslandskap av två flytande tillstånd skulle vara närvaron av en stor droppe rik på biopolymerer som driver LLPS57,58.Droptillväxt kan uppnås genom Ostwald-mognad59, koalescens60 eller konsumtion av fri monomer i den dispergerade fasen61.För αS och Tau441, ΔNt-Tau eller pLK koncentrerades det mesta av proteinet i kondensatet under de betingelser som användes i denna studie.Medan tau-droppar i full storlek koaleserade snabbt vid ytvätning, var dock droppsammansmältning och vätning svåra för ΔNt-Tau och pLK, vilket tyder på en snabb förlust av vätskeegenskaper i dessa två system.Enligt vår FLIM-FRET-analys visade de åldrade pLK- och ΔNt-Tau-dropparna en liknande grad av proteinaggregation (liknande fluorescenslivslängd) som de ursprungliga dropparna, vilket tyder på att det ursprungliga proteinnätverket bibehölls, om än mer styvt.
Vi rationaliserar våra experimentella resultat i följande modell (Figur 8).De initialt temporärt bildade dropparna är ofta proteinnätverk utan elektrostatisk kompensation, och det finns således områden med laddningsobalans, speciellt vid droppgränssnittet, vilket resulterar i droppar med en hög elektrostatisk ytpotential.För att kompensera för laddning (ett fenomen som vanligtvis kallas valensutarmning) och minimera ytpotentialen hos dropparna, kan dropparna inkludera nya polypeptider från den utspädda fasen, omorganisera proteinnätverk för att optimera laddningsladdningsinteraktioner och interagera med andra droppar.med ytor (vätning).αS/pLK-dropparna, på grund av deras enklare proteinnätverk (endast heterotypiska interaktioner mellan αS och pLK) och större affinitet för protein-protein-interaktioner, verkar kunna balansera kondensatets laddning snabbare;faktiskt, vi observerade snabbare proteinkinetik i initialt bildade αS/pLK-koacervat än i αS/Tau.Efter valensutarmning blir interaktionerna mindre efemära och dropparna förlorar sina vätskeegenskaper och förvandlas till gelliknande, icke brännbara droppar med låg elektrostatisk ytpotential (och därför oförmögna att väta ytan).Däremot är αS/Tau-droppar mindre effektiva för att optimera droppladdningsbalansen på grund av mer komplexa proteinnätverk (med både homotypa och heterotypa interaktioner) och den svagare naturen hos proteininteraktioner.Detta resulterar i droppar som bibehåller vätskebeteendet under långa tidsperioder och uppvisar en hög elektrostatisk ytpotential som tenderar att minimeras genom att koalescera och växa (och därigenom minimera förhållandet ytarea/volym för dropparna) och genom att väta den hydrofila ytkemikalien.Detta skapar stora koncentrerade proteinbibliotek som behåller vätskeegenskaper eftersom interaktionerna förblir mycket övergående på grund av det ständiga sökandet efter laddningsoptimering i proteinnätverket.Intressant nog uppvisar N-terminalt trunkerade former av Tau, inklusive några naturligt förekommande isoformer62, intermediärt beteende, där vissa koacervat åldras med αS till långlivade gelliknande droppar, medan andra omvandlas till stora flytande kondensat.Denna dualitet i mognad av αS elektrostatiska koacervat överensstämmer med nyare LLPS teoretiska och experimentella studier som har identifierat en korrelation mellan valensutarmning och elektrostatisk siktning i kondensat som en nyckel till att kontrollera kondensatstorlek och vätskeegenskaper.Mekanism 58,61.
Detta schema visar den förmodade amyloidaggregationsvägen för αS och Tau441 via LLPS och LSPT.Med ytterligare anjonrika (röda) och katjonrika (blå) regioner, har αS och tau elektrostatiska koacervat med tillfredsställande valens lägre ytenergi och därför mindre koalescens, vilket resulterar i snabb droppåldring.Ett stabilt icke-agglomererat geltillstånd uppnås..Denna situation är mycket gynnsam i fallet med αS/pLK-systemet på grund av dess högre affinitet och enklare protein-par-interaktionsnätverk, vilket möjliggör en snabb gelliknande övergång.Tvärtom, droppar med otillfredsställande valens och därför proteinladdade områden tillgängliga för interaktion, gör det lättare för koacervatet att smälta samman och väta den hydrofila ytan för att minska dess höga ytenergi.Denna situation är att föredra för αS/Tau441-koacervat, som har ett multivalent komplext nätverk bestående av svaga Tau-Tau- och αS-Tau-interaktioner.I sin tur kommer större koacervat lättare att behålla sina vätskeliknande egenskaper, vilket gör att andra protein-till-protein-interaktioner kan inträffa.Så småningom bildas amyloida heterogena aggregat som innehåller både αS och tau i koacervatvätskan, vilket kan vara relaterade till de som finns i inklusionskroppar, vilket är kännetecken för neurodegenerativa sjukdomar.
De stora vätskeliknande strukturerna som bildas under mognad av αS/Tau441 med en mycket överbelastad men dynamisk proteinmiljö och, i mindre utsträckning, αS/ΔNt-Tau-koacervat är idealiska reservoarer för kärnbildning av proteinaggregation.Vi har verkligen observerat bildandet av fasta proteinaggregat i denna typ av proteinkoacervat, som ofta innehåller både αS och tau.Vi har visat att dessa heteroaggregat stabiliseras av icke-elektrostatiska interaktioner, kan binda amyloidspecifika ThT-färgämnen på samma sätt som typiska amyloidfibriller och faktiskt har liknande motståndskraft mot olika influenser.αS/tau-aggregaten bildade av LLPS visades ha amyloidliknande egenskaper.Faktum är att den mogna varianten av Tau som saknar amyloidaggregation är signifikant försämrad i bildningen av dessa heterogena αS-aggregat i det flytande elektrostatiska koacervatet.Bildandet av αS/Tau441-aggregat observerades endast inuti koacervaten, som bibehöll vätskeliknande egenskaper, och aldrig, om koacervaten/dropparna inte nådde geltillståndet.I det senare fallet förhindrar den ökade styrkan hos elektrostatiska interaktioner och, som ett resultat, styvheten hos proteinnätverket de nödvändiga konformationella omarrangemang av proteiner för att etablera nya proteininteraktioner som är nödvändiga för amyloidkärnbildning.Detta kan dock uppnås i mer flexibla, vätskeliknande koacervat, som i sin tur är mer benägna att förbli flytande när de ökar i storlek.
Det faktum att bildningen av aggregat inom den kondenserade fasen är att föredra i stora αS/Tau-kondensat än i små droppar som snabbt gelar, understryker relevansen av att identifiera de faktorer som styr droppens koalescens.Det finns alltså inte bara en tendens till fasseparation, utan även storleken på kondensatet måste kontrolleras för att fungera korrekt och för att förebygga sjukdomar58,61.Våra resultat visar också vikten av balansen mellan LLPS och LSPT för αS/Tau-systemet.Även om droppbildning kan skydda mot amyloidaggregation genom att minska mängden proteinmonomerer som är tillgängliga under mättnadsförhållanden, som har föreslagits i andra system63,64, kan droppfusion vid höga droppnivåer leda till intern proteinaggregation genom långsamma konformationella omarrangemang.proteinnätverk..
Sammantaget betonar våra data starkt relevansen av kohesiv valens och nöjda/otillfredsställda interaktioner i drop-nätverk i samband med LSPT.I synnerhet visar vi att αS/Tau441-kondensat i full längd kan effektivt smälta samman och bilda kärnor för att bilda amyloidliknande heteroaggregat som inkluderar både proteiner och föreslår en molekylär mekanism baserat på våra experimentella resultat.Samaggregationen av två proteiner i αS/Tau-vätskekoacervatet som vi rapporterar här kan verkligen vara relaterat till samlokaliseringen av två proteiner i inneslutningar, som är kännetecken för sjukdomen, och kan bidra till att förstå sambandet mellan LLPS och amyloidaggregation, vilket banar väg för högt laddad IDP vid neurodegeneration.
Monomera WT-αS, cysteinmutanter (Q24C-αS, N122C-αS) och ΔCt-αS varianter (Δ101-140) uttrycktes i E. coli och renades som tidigare beskrivits.5 mM DTT inkluderades i alla steg i reningen av αS-cysteinmutanter för att förhindra bildning av disulfidbindningar.Tau441-isoform (plasmid erhållen från Addgene #16316), ΔNt-Tau-variant (Δ1–150, erhållen genom kloning av IVA med primers CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) och AggDef-1CTer-variant, 5,7C renad med EGGDef-1CT,5C-variant. coli-kulturer var odlade till OD600 = 0,6–0,7 vid 37°C och 180 rpm, och expression inducerades med IPTG i 3 timmar vid 37°C.Skörda celler vid 11 500 xg i 15 minuter vid 4 ° C och tvätta med saltlösningsbuffert innehållande 150 mM NaCl.Återsuspendera pelleten i lysbuffert (20 ml per 1 L LB: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, bensamidin 50 μM, copeptin 100).Sonikeringssteget utfördes på is med en amplitud på 80 % under 10 pulser (1 min på, 1 min av).Överskrid inte 60 ml i ett ultraljud.E. coli-lysat värmdes vid 95°C under 20 minuter, kyldes sedan på is och centrifugerades vid 127 000 xg under 40 minuter.Den klarnade supernatanten applicerades på ett 3,5 kDa membran (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Storbritannien) och dialyserades mot 4 L dialysbuffert (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM PMSF 0,1 mM) i 10 timmar.En 5 ml katjonbytarkolonn (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, USA) ekvilibrerades med jämviktsbuffert (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau-lysatet filtrerades genom ett 0,22 μm PVDF-filter och injicerades i kolonnen med en flödeshastighet av 1 ml/min.Eluering utfördes gradvis, tau eluerades med 15–30 % elueringsbuffert (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Fraktioner analyserades med SDS-PAGE, och alla fraktioner som innehöll ett band med den förväntade molekylvikten för tau koncentrerades med användning av ett 10 kDa centrifugfilter och ersattes med en buffert innehållande 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM och DTT 2 mM för den slutliga proteinkoncentrationen var 100 μM.Proteinlösningen passerades sedan genom ett 0,22 μm PVDF-filter, frystes snabbt och förvarades vid -80°C.Protein K18 tillhandahölls vänligt av prof. Alberto Boffi.Beredningens renhet var >95 %, vilket bekräftades av SDS-PAGE och MALDI-TOF/TOF.Olika cysteiner märktes kemiskt med AlexaFluor488-maleimid (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) eller TEMPOL-maleimid (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).bekräftades genom absorbans och MALDI-TOF/TOF.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau och K18 märktes med naturliga cysteinrester vid positionerna 191 och 322 med användning av Atto647N-maleimid (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Tyskland) enligt samma procedur.Nettoladdning per rest kartor för αS och Tau441 genererades med användning av CIDER66.
Fast poly-L-lysin (pLK DP 90-110 enligt NMR från leverantör, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, USA) löstes i 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 till 10 mM koncentration, ultraljudsbehandling i 5 minuter i ett ultraljudsvattenbad och förvara vid -20°C.PEG-8, dextran-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, USA) och FITC-dextran-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, USA) är vattenlösliga och brett distribuerade i LLPS-buffert.Dialys tar bort förorenande salter.De filtrerades sedan genom ett sprutfilter med en porstorlek på 0,22 μm, och deras koncentrationer beräknades med hjälp av en refraktometer (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, USA).LLPS-prover preparerades vid rumstemperatur i följande ordning: buffert och extrudering blandades och 1 mM tris(2-karboxietyl)fosfin (TCEP, Carbosynth, Compton, Storbritannien), 1 mM 2,2,2,2-(etan- 1,2-diyldinitril) tetraättiksyra (EDTA, karboxynt) och en blandning av 1% proteashämmare (PMSF 100 mM, bensimid 1 mM, leupeptin 5 μM).Sedan tillsätts αS och fuserade polykatjoner (alternativ pLK eller Tau).För tioflavin-T-tidsserieexperiment (ThT, Carbosynth, Compton, Storbritannien), använd den totala ThT-koncentrationen för att vara hälften av αS-koncentrationen.Blanda försiktigt men noggrant proverna för att säkerställa att de är homogena.Koncentrationen av varje komponent varierade från experiment till experiment, som beskrivs i avsnittet Resultat.Azid användes i en koncentration av 0,02 % (vikt/volym) närhelst experimentets varaktighet översteg 4 timmar.För alla analyser med LLPS-prover, låt blandningen komma i jämvikt i 5 minuter före analys.För ljusspridningsanalys laddades 150 µl prover på icke-bindande 96-brunnars mikroplattor (µClear®, svart, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Österrike) och täcktes med adhesiv film.LLP:er övervakades genom att mäta absorbansen vid 350 nm i mitten av lösningen i en CLARIOstar plattläsare (BMG Labtech, Ortenberg, Tyskland).Experimenten utfördes i tre exemplar vid 25°C, och felen beräknades som standardavvikelsen från medelvärdet.Den utspädda fasen kvantifierades genom provcentrifugering och SDS-PAGE-gelanalys, och αS-fraktionen i den utspädda och koncentrerade fasen kvantifierades i olika LLPS-lösningar.Ett 100 μl LLPS-prov innehållande 1 μM AF488-märkt αS preparerades genom noggrann blandning följt av centrifugering vid 9600×g i 30 minuter, varefter fällningen vanligtvis var synlig.De översta 50 μl av supernatanten användes för proteinkvantifiering med SDS-PAGE-gel.Geler skannades med AF488-filter med användning av ett ChemiDoc-gelavbildningssystem (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) eller färgades med Coomassie-färgning och visualiserades med lämpliga filter.De resulterande banden analyserades med hjälp av ImageJ version 1.53i (National Institutes of Health, USA).Experimenten utfördes i duplikat i två olika experiment med liknande resultat.
Vanligtvis applicerades 150 μl prover på icke-bindande 96-brunnars mikroplattor och visualiserades vid rumstemperatur på ett Leica DMI6000B inverterat mikroskop (Leica Microsystems, Wetzlar, Tyskland).För fläckexperiment användes också µ-Slide Angiogenesis-plattor (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Tyskland) eller 96-brunnars polystyrenmikroplattor (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts).EL6000 halogen- eller kvicksilvermetallhalogenlampor användes som belysningskällor (för BF/DIC- respektive WF-avbildning).För WF-mikroskopi användes ett luftobjektiv med 40x förstoring (Leica Microsystems, Tyskland) för att fokusera ljuset på provet och samla in det.För AF488- och ThT-märkta prover, filterexcitering och emission med standard GFP-filteruppsättningar, excitations- och emissionsbandpassfilter, respektive 460–500 nm och 512–542 nm bandpassfilter, och en 495 nm dikroisk spegel.För prover märkta med Atto647N användes en standarduppsättning Cy5-filter med excitations- och emissionsbandpassfilter 628–40 nm respektive 692–40 nm och en 660 nm dikroisk spegel.För BF- och DIC-mikroskopi, använd samma objektiv för insamling av reflekterat ljus.Det uppsamlade ljuset registrerades på en Leica DFC7000 CCD-kamera (Leica Microsystems, Tyskland).Exponeringstiden var 50 ms för BF- och DIC-mikroskopi och 20-100 ms för WF-mikroskopi.Som jämförelse var exponeringstiden för alla experiment med ThT 100 ms.Time-lapse-experiment utfördes för att visualisera droppkoalescens, med bilder som samlades in var 100:e ms under flera minuter.ImageJ (NIH, USA) användes för bildanalys.Experimenten utfördes i tre exemplar med liknande resultat.
För kolokaliseringsexperiment, FRAP och 3D-rekonstruktion, förvärvades bilder på ett Zeiss LSM 880 inverterat konfokalmikroskop med hjälp av en ZEN 2 blå utgåva (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Tyskland).Prover på 50 µl applicerades på µ-Slide Angiogenesis Petriskålar (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Tyskland), behandlade med en hydrofil polymer (ibiTreat) och monterade i ett 63× oljedoppningsobjektiv (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) på DIC).Bilder togs med hjälp av 458 nm, 488 nm och 633 nm argonlaserlinjer med en upplösning på 0,26 µm/pixel och en exponeringstid på 8 µs/pixel för excitations- och emissionsdetekteringsfönster på 470–600 nm, 493–nm, 68 och 638–755 nm användes för att visualisera ThT, AF488 respektive Atto647N.För FRAP-experimenten registrerades time-lapse-fotografering av varje prov med 1 bildruta per sekund.Experimenten utfördes i tre exemplar vid rumstemperatur med liknande resultat.Alla bilder analyserades med Zen 2 blue edition programvara (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Tyskland).FRAP-kurvorna normaliserades, plottades och anpassades till intensitets-/tidsdata extraherat från bilder med Zen 2 med OriginPro 9.1.Återhämtningskurvorna anpassades till en mono-exponentiell modell för att ta hänsyn till molekylär diffusion med en ytterligare exponentiell term för att redogöra för förvärvsblekningseffekten.Vi beräknade sedan D med hjälp av den nominella blekningsradien och den tidigare bestämda återhämtningshalveringstiden som i ekvationen av Kang et al.5 35 visas.
Enstaka cysteinvarianter av αS syntetiserades med 4-hydroxi-2,2,6,6-tetrametylpiperidin-N-oxyl (TEMPOL) i positionerna 24 (TEMPOL-24-αS) och 122 (TEMPOL-122-αS), respektive.Spin-märkning För EPR-experiment sattes αS-koncentrationen till 100 μM och PEG-koncentrationen var 15 % (vikt/volym).För olika aggregeringsförhållanden var αS:pLK-förhållandet 1:10, medan förhållandet αS:ΔNt-Tau och αS:Tau441 hölls vid 1:1.För bindningstitreringsexperiment i frånvaro av trängsel hölls TEMPOL-122-αS vid 50 μM och polykatjoner titrerades i ökande koncentrationer, varvid varje tillstånd förbereddes separat.CW-EPR-mätningar utfördes med användning av en Bruker ELEXSYS E580 X-bandspektrometer utrustad med en Bruker ER4118 SPT-N1-resonator som arbetar vid en mikrovågsfrekvens (SHF) på ~9,7 GHz.Temperaturen inställdes på 25°C och kontrollerades av en flytande kvävekryostat.Spektra erhölls under omättade förhållanden vid en MW-effekt på 4 mW, en moduleringsamplitud på 0,1 mT och en moduleringsfrekvens på 100 kHz.Spektralintensiteter normaliserades för att undvika skillnader i spinnkoncentrationer mellan prover och möjlig spinnreduktion på grund av kvarvarande koncentrationer av reduktionsmedel i prover innehållande Tau441 eller ΔNt-Tau (närvarande i de ursprungliga proteinlösningarna).De givna värdena på g erhölls som ett resultat av EPR-spektralmodellering utförd med Easyspin-mjukvaran (v. 6.0.0-dev.34) implementerad i Matlab®67.En/tvåkomponents isotropa modeller användes för att modellera data.Efter normalisering av alla signaler beräknades resterna genom att subtrahera varje simulering från motsvarande experimentella spektrum.För bindningstitreringsanalys användes den relativa intensiteten av det tredje bandet till det andra bandet i det normaliserade EPR-spektrumet (IIII/III) för att övervaka bindningen av polykatjoner till αS.För att uppskatta dissociationskonstanten (Kd), anpassades den resulterande kurvan till en ungefärlig modell som antog n identiska och oberoende bindningsställen.
NMR-spektroskopiexperiment utfördes med användning av en Bruker Neo 800 MHz (IH) NMR-spektrometer utrustad med en kryosond och Z-gradient.Alla experiment utfördes med användning av 130–207 µM αS och motsvarande αS/ΔNt-Tau och pLK-ekvivalenter i 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10% DO, pH 7,4 och utfördes vid 15°C.För att övervaka LPS med NMR tillsattes 10 % PEG till de förblandade proverna.Det kemiska skiftstörningsdiagrammet (Fig. 1b) visar de genomsnittliga 1H och 15N kemiska skiftningarna.αS 2D1H-15N HSQC-spektra tilldelades baserat på en tidigare tilldelning (BMRB-post #25227) och bekräftades genom att registrera och analysera 3D-spektra för HNCA, HNCO och CBCAcoNH.13Ca och 13Cp kemiska skift beräknades i närvaro av ΔNt-Tau eller pLK för att mäta möjliga förändringar i sekundära strukturtrender jämfört med αS kemiska skift i ren slumpmässig spolkonformation 68 (kompletterande figur 5c).R1ρ-hastigheterna mättes genom att registrera hsqctretf3gpsi-experiment (erhållna från Bruker-biblioteket) med fördröjningar på 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 och 800 ms, och exponentialfunktionerna justerades till toppintensitetsfördröjningarna gånger för att bestämma R1ρ och dess experimentella osäkerhet.
Tvåfärgs tidsupplösta fluorescensmikroskopiexperiment utfördes på ett kommersiellt tidsupplöst MT200 fluorescenskonfokalmikroskop (PicoQuant, Berlin, Tyskland) med en tidskorrelerad enkelfotonräkningsanordning (TCSPC).Laserdiodhuvudet används för pulsad interfolierad excitation (PIE), strålen passerar genom en singelmodsvågledare och är avstämd till en lasereffekt på 10 till 100 nW för 481 nm och 637 nm laserlinjer uppmätta efter en dikroisk spegel.Detta säkerställer en optimal fotonräkningshastighet och undviker effekterna av fotonaliasing, fotoblekning och mättnad.μ-Slide angiogenes täckglas eller plattor (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Tyskland) placerades direkt i nedsänkningsvatten över en Super Apochromat 60x NA 1.2 lins med en korrigerande krage (Olympus Life Sciences, Waltham, USA).En 488/640 nm dikroisk spegel (Semrock, Lake Forest, IL, USA) användes som huvudstråldelare.Ofokuserad strålning blockeras av ett hål med en diameter på 50 mikron, sedan delas den fokuserade strålningen upp i 2 detekteringsvägar av en 50/50 stråldelare.Bandpass-emissionsfilter (Semrock, Lake Forest, IL, USA) 520/35 för grönt färgämne (AF488) och 690/70 för rött färgämne (Atto647N) användes framför detektorn.Enkelfoton lavindioder (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italien) användes som detektorer.Både datainsamling och analys utfördes med den kommersiellt tillgängliga programvaran SymphoTime64 (PicoQuant GmbH, Berlin, Tyskland).
Femtio mikroliter LLPS-prov applicerades på μ-Slide angiogenesbrunnar (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Tyskland).De resulterande bilderna fokuseras till 20 µm över brunnsbotten för optimalt objektivarbetsavstånd för svävande droppar och till ~1 µm för flottar och punkter med en axiell upplösning på minst 0,25 µm/pixel och en fördröjningstid på 400 µs/pixel.Välj data genom att tillämpa en intensitetströskel baserad på den genomsnittliga bakgrundssignalintensiteten (PBG, medelvärde + 2σ) för varje kanal så att endast flytande proteindroppar, flottar eller fläckar väljs, vilket filtrerar bort alla möjliga ursprung från den dispergerade fasen.För att analysera livslängden för varje art (τ) i varje kanal (grön, "g" för AF488 och röd, "r" för Atto647N), valde vi områden av intresse (ROI) som innehåller droppar, flottar eller fläckar (kompletterande figur 1) ).8b) och härledde dem genom att passa deras livstidsavklingning (τD, τR och τP för droppar, flottar respektive fläckar, se tilläggsbild 8c) i varje kanal med användning av en svanspassningsanalys och en tvåkomponentsavklingningsmodell.Genomsnittlig τ från τ .ROI som producerade för få fotoner för en multi-exponentiell passning uteslöts från analysen.Cutoff som användes var <104 fotoner för flottar och prickar och 103 för droppar.Dropparna har en lägre tröskel eftersom det är svårt att få sönderfallskurvor med högre intensitetsvärden, eftersom dropparna i bildfältet vanligtvis är mindre och mindre många.ROI med fotonantal över fotonackumuleringsgränsen (inställd på >500 räkningar/pixel) kasserades också för analys.Matcha kurvan för intensitetsavklingningen som erhålls från området av intresse med en intensitet på 90 % av maximum (något efter sönderfallets maximala intensitet) från början av livslängden för att säkerställa minimal IRF-interferens samtidigt som densamma bibehålls för all intensitetsavklingning inställningar Relativt tidsfönster Analyserades 25 till 50 ROI för flottar och fläckar och 15-25 ROI för droppar, bilder valda från fler än 4 replikat inspelade från minst 3 oberoende experiment.Tvåsidiga t-tester har använts för att utvärdera statistiska skillnader mellan arter eller mellan koacervatsystem.För en pixel-för-pixel-analys av livslängden (τ) beräknades den totala dämpningen av livslängden över fältet för varje kanal och en approximation av en 2/3-komponents exponentiell dämpningsmodell utfördes.Livstidsdämpningen för varje pixel anpassades sedan med tidigare beräknade τ-värden, vilket resulterade i en pseudofärgad FLIM-passningsbild.Livslängden för tail-fit var densamma för alla bilder av samma kanal, och varje sönderfall producerade tillräckligt många fotoner för att ge en tillförlitlig passform.För FRET-analys valdes pixlar genom att applicera en lägre intensitetströskel på 100 fotoner, vilket i genomsnitt gav en bakgrundssignal (FBG) på 11 fotoner.Fluorescensintensiteten för varje kanal korrigerades med experimentellt bestämda korrektionsfaktorer: 69 spektral överhörning α var 0,004, direkt excitation β var 0,0305, detektionseffektiviteten y var 0,517.FRET-effektiviteten på pixelnivå beräknas sedan med hjälp av följande ekvation:
där FDD är fluorescensintensiteten som observeras i donatorkanalen (grön), FDA är fluorescensintensiteten observerad i acceptorkanalen (röd) under indirekt excitation, och FAA är fluorescensintensiteten som observeras i acceptorkanalen (röd) under direkt excitation ( PAJ).Fluorescensintensitetspulser observeras i kanalen).
Placera 100 µl LLPS-reaktionslösningar innehållande 25 µM omärkt monomer Tau441 (med eller utan 25 µM αS) i LLPS-buffert (kompletterad enligt ovan) på icke-bindande 96-brunnars mikroplattor med självhäftande foliebeläggning och droppbildning kontrollerades med WF-mikroskopi. jämvikt.inom 10 min.Efter 48 timmars inkubation vid rumstemperatur bekräftades närvaron av proteinflottar och fläckar.Ta sedan försiktigt bort vätskan över flottarna från brunnarna, tillsätt sedan 50 L dissociationsbuffert (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) och inkubera i 10 min.Den höga saltkoncentrationen säkerställer att LLPS inte upprepas på grund av kvarvarande PEG, och eventuella proteinsammansättningar som endast bildas av elektrostatiska interaktioner kommer att tas isär.Brunnens botten skrapades sedan försiktigt bort med en mikropipettspets och den resulterande lösningen överfördes till en tom observationsbrunn.Efter inkubation av proverna med 50 μM ThT under 1 timme, kontrollerades närvaron av isolerade fläckar med WF-mikroskopi.Förbered ultraljudsbehandlade αS-fibriller genom att inkubera 300 µl av en 70-µM αS-lösning i PBS med pH 7,4, natriumazid 0,01 % vid 37 °C och 200 rpm på en orbital shaker i 7 dagar.Lösningen centrifugerades sedan vid 9600 xg under 30 minuter, pelleten återsuspenderades i PBS pH 7,4 och sonikerades (1 min, 50 % cykel, 80 % amplitud i en Vibra-Cell VC130 sonikator, Sonics, Newton, USA) fibrilprover med en relativt enhetlig storleksfördelning av små fibriller.
FCS/FCCS-analys och tvåfärgs-koincidensdetektion (TCCD) utfördes på samma MT200 tidsupplösta fluorescerande konfokalmikroskop (Pico-Quant, Berlin, Tyskland) som användes för FLIM-FRET-mikroskopiexperimenten med PIE-läge.Lasereffekten för dessa experiment sattes till 6,0 µW (481 nm) och 6,2 µW (637 nm).Kombinationen av dessa laserkrafter valdes för att producera liknande ljusstyrka för paren av fluoroforer som används samtidigt som man uppnådde optimala räknehastigheter och undviker fotoblekning och mättnad.Både datainsamling och analys utfördes med den kommersiellt tillgängliga programvaran SymphoTime64 version 2.3 (PicoQuant, Berlin, Tyskland).
Prover av isolerade αS/Tau-aggregat erhållna med LLPS späds i isoleringsbuffert till lämplig monomolekylär koncentration (vanligtvis en 1:500-spädning, eftersom aggregat redan har låga koncentrationer när de isoleras från koacervatprover).Prover applicerades direkt på täckglas (Corning, USA) förbelagda med en BSA-lösning i en koncentration av 1 mg/ml.
För PIE-smFRET-analysen i de gröna och röda kanalerna applicerades en lägre intensitetströskel på 25 fotoner för att filtrera bort lågintensitetssignaler orsakade av monomera händelser (observera att monomerer är fler än aggregerade prover jämfört med isolerade aggregat).Detta tröskelvärde beräknades som fem gånger den genomsnittliga intensiteten av monomert αS erhållet från analysen av rena monomerprover för att specifikt välja aggregat för analys.PIE-drivkretsen, tillsammans med TSCPC-datainsamling, har möjliggjort tillämpningen av ett livstidsviktningsfilter som hjälper till att eliminera bakgrund och spektral överhörning.Den flare intensitet som valdes med användning av ovanstående tröskelvärden korrigerades med hjälp av den genomsnittliga bakgrundssignalen bestämd från histogrammen för förekomsten kontra intensiteten/bin för de buffertbara proverna.Bursts associerade med stora aggregat upptar vanligtvis flera på varandra följande fack i tidskurvan (inställd på 1 ms).I dessa fall valdes en behållare med maximal styrka.För FRET och stökiometrisk analys användes den teoretiskt bestämda gammafaktorn y (0,517).Spektral överhörning och direkt excitationsbidrag är försumbara (bestäms experimentellt) vid den använda excitationslasereffekten.Verkningsgraden och stökiometrin för FRET i en explosion beräknas enligt följande.