347 rullade rör av rostfritt stål kemisk komponent, Identifiering av nya interferon-responsiva humana leukocytantigen-A (HLA-A) chaperonproteiner med hjälp av tvärbunden masspektrometri (CLMS)

Tack för att du besöker Nature.com.Du använder en webbläsarversion med begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Dessutom, för att säkerställa löpande support, visar vi webbplatsen utan stilar och JavaScript.
Reglage som visar tre artiklar per bild.Använd bakåt- och nästaknapparna för att flytta genom bilderna, eller skjutkontrollknapparna i slutet för att flytta genom varje bild.

Produktbeskrivning

Rostfritt stål 347L spiralrör, stålkvalitet: SS347L

Interferonsignaleringssystemet inducerar ett starkt cytokinsvar på ett brett spektrum av patogena och inneboende patologiska signaler från omgivningen, vilket resulterar i induktion av undergrupper av interferon-inducerbara proteiner.Vi tillämpade DSS-medierad tvärbindningsmasspektrometri (CLMS) för att detektera nya protein-protein-interaktioner i domänen av interferon-inducerade proteiner.Förutom de förväntade interferon-inducerbara proteinerna identifierade vi också nya intermolekylära och intramolekylära tvärbundna addukter av kanoniska interferon-inducerbara proteiner som MX1, USP18, OAS3 och STAT1.Vi fokuserade på ortogonal validering av en ny uppsättning interferon-inducerbara proteinnätverk bildade av HLA-A-proteiner (H2BFS-HLA-A-HMGA1) med hjälp av co-immunoprecipitation och deras vidare studie med molekylär dynamikmodellering.Modellering av konformationsdynamiken hos proteinkomplexet avslöjade flera interaktionsställen som återspeglade de interaktioner som identifierats i CLMS-fynden.Tillsammans presenterar vi en pilotstudie av CLMS för att identifiera nya signalkomplex inducerade av interferon, och ser fram emot den bredare användningen av CLMS för att identifiera ny dynamik av proteininteraktioner i tumörmikromiljön.
Innan ett adaptivt immunsvar börjar, sätter värdens medfödda försvarssystem upp ett antimikrobiellt svar förmedlat av en familj av utsöndrade alfa-heliska cytokiner som kallas interferoner (IFN).Typ I IFN-klasserna IFNa och IFNβ aktiverar cellulära svar, inklusive antivirala, proapoptotiska, proinflammatoriska och antiproliferativa tillstånd.Hos människor är 13 undertyper av IFNa kända, alla klustrade på kromosom 91. Överraskande nog har endast IFNα2 studerats för klinisk användning.Nyligen har särskild uppmärksamhet ägnats forskning på andra subtyper av IFNa.En nyligen genomförd studie visade att IFNα14 är en av de mest effektiva isoformerna för att begränsa HBV2- och HIV-13,4-replikation jämfört med den kanoniska IFNa2-subtypen.
Det har fastställts att aktiverade typ I-interferonreceptorkomplex (IFNAR1 och IFNAR2) utlöser en signaltransduktionskaskad som förmedlas av Janus-kinaserna TYK2 och JAK15,6.Dessa Janus-kinaser fosforylerar signalomvandlare och transkriptionella proteinaktivatorer (STAT1 och STAT2) på tyrosinrester för att initiera SH2-domänförmedlad heterodimerisering6.Därefter binder IRF9 STAT-heterodimerer för att bilda ett trimeriskt komplex av den IFN-stimulerade faktor 3-genen (ISGF3), som translokeras till kärnan och inducerar transkriptionen av över 2000 interferonstimulerade gener (ISG)5,6,7,8.
ISG: er utgör ryggraden i det medfödda immunsystemet, särskilt som svar på virusangrepp.Som en första försvarslinje mot virusinfektion utvecklar celler snabbt omfattande interaktioner av cellulära proteiner med ett brett utbud av biologiska aktiviteter.Dessa proteiner inkluderar mönsterigenkänningsreceptorer, signalmolekyler, transkriptionsfaktorer och proteiner med direkta antivirala funktioner, såväl som negativa regulatorer av immunsvar9.Mycket av informationen om ISG-aktivitet kommer från funktionella skärmar som använder överuttrycksskärmar10,11 eller gentysta tekniker (siRNA, RNAi och CRISPR)12,13 där individuella ISG uttrycks eller hämmas och deras aktivitet testas på olika virus.Även om dessa studier har bestämt de antivirala egenskaperna hos individuella ISG, är de underliggande molekylära mekanismerna för varje ISG i stort sett okända.Det är allmänt accepterat att många proteiner interagerar med en eller flera cytokiner för att säkerställa full aktivitet, så antingen interagerar ISGs direkt eller så förmedlas deras interaktioner av cellulära proteiner.Till exempel identifierade en nyligen fototvärbunden proteomikstudie ATPase VCP/p97 som en viktig IFITM3-interaktionspartner, vars hämning leder till defekter i lysosomal sortering, omsättning och samtransport av IFITM3 med virala partiklar 14 .Med hjälp av immunoutfällning identifierade vi VAPA, ett vesikelassocierat protein, som en interaktionspartner med IFITM1/2/3 som förmedlar kolesterolmedierad viral mognad, och detta bekräftades av en annan studie med ett tvåhybridsystem av jäst.Vetenskapligt stöd 15 , 16 .
En grundläggande biologisk process involverad i undertryckandet av infektion och malign transformation är antigenpresentation, som förmedlas av MHC-molekyler (major histocompatibility complex).Peptider (8-12 aminosyror långa) från kluvna, för tidigt avslutade eller felveckade proteiner laddas in i MHC-I-heterodimeren (bestående av MHC-I tunga och lätta kedjor, kallade β-2-mikroglobulin; β2M) 17,18.De resulterande stabila MHC-I-trimererna transporteras till cellytan, där de presenterar intracellulära peptider till CD8+ T-celler (cytotoxiska T-celler)17.T-celler känner igen och förstör dessa patogener och celler som bär ett tumörspecifikt antigen.Följaktligen undertrycker patogener och tumörceller ofta antigenpresentationsprocessen för att undvika immunövervakning.Dessutom är MHC-I nedreglerad i 40-90 % av mänskliga tumörer och är ofta förknippad med en sämre prognos19.
Gener som är involverade i att svara på patogener måste snabbt växla mellan ett vilotillstånd och ett tillstånd av aktiv transkription.Därför antas flera cellulära proteiner vara involverade i svaret på hög IFN-efterfrågan under korta tidsperioder, inklusive ombyggnad och modifiering av promotorkromatin 20,21.De flesta studier har fokuserat på identifiering av individuella ISG-proteinpartners i närvaro av IFN.Flera proteomiska och transkriptomiska studier i modellcellsystem har klarlagt effekten av IFN på det cellulära landskapet.Men trots en växande förståelse för dynamiken som induceras av interferoner, vet vi fortfarande lite om involveringen av ISG.När man överväger komplexiteten och den tidsberoende dynamiken hos interferonsignalering uppstår två frågor: (i) är det möjligt att stabilisera och fånga multiproteinkomplexen involverade i snabb signalering, och (ii) kan dessa interaktioner kartläggas i 3D-rymden?
För att ta itu med dessa problem implementerade vi disuccinimid-suberat-medierad kemisk tvärbindning (DSS) i kombination med masspektrometri (CLMS) för att studera det IFNa-inducerade proteininteraktionsnätverket och dess dynamik.DSS lägger till kovalenta bindningar mellan proximala rester av proteiner och/eller proteinkomplex in vivo.Efterföljande MS-analys avslöjar specifika tvärbindningsställen som återspeglar den rumsliga närheten av regioner inom ett visst protein, kallade interna länkar, eller subenheter i proteinkomplex, kallade interrelationer.Med detta tillvägagångssätt har vi identifierat flera nya protein-proteinkomplex såväl som interferoninducerade multiproteininteraktionsnätverk.Genom att ytterligare testa en delmängd av dessa nya interaktioner, visar vi att H2BFS (H2B histon-typ FS, nedan kallad H2B) och MDN1 fungerar som bindande partners för HLA-A.
Flo-1-celler är en av de mest kända in vitro-modellerna av esofagusadenokarcinom eftersom de efterliknar nyckelfunktioner hos esofageala tumörer22,23.Alla tumörer är dock inte immunogena och för att avgöra om Flo-1-celler svarar på interferonbehandling behandlade vi Flo-1-celler med 10 ng/ml IFNa i 72 timmar.Flo-1-celler visade tidig induktion av pSTAT1 och IRF1, med början 2 timmar efter behandling och fortsatte i 72 timmar, med en tidsberoende minskning av stationära nivåer av IRF1 (Figur 1A).ISGs (MX1, IFITM1, OAS1/2 och ISG15) visade sig vara starkt inducerade efter 6 timmar, vilket efterliknar de klassiska mitt- och senfassvaren på IFNa (Figur 1A).Tillsammans tyder dessa data på att denna cellulära modell kan användas för att studera interferonsvar.
Differentiella proteinuttryckssvar i Flo-1-celler efter IFNa-behandling.(A) Proteinuttryck i Flo-1-celler behandlade med 10 ng/ml IFNa under 2, 6, 24, 48 och 72 timmar analyserades genom immunoblot med användning av de angivna ISG-antikropparna.(B) Coomassie-blåttfärgade SDS-PAGE-geler av helcellsextrakt efter tvärbindning med DSS under angivna tider och koncentrationer.(C) Representativ immunoblot undersökt med p53(DO-1)-antikropp från samma prover för att bedöma graden av proteintvärbindning.
För att fånga in situ proteininteraktionslandskapet använde vi DSS, ett allmänt använt tvärbindningsmedel på grund av dess höga membranpermeabilitet och relativt korta reaktionstid.Den kortare reaktionstiden hjälper till att förhindra bildandet av stora aggregat av tvärbundna proteiner, och bibehåller därigenom tvärbindarens stabilitet.För att bestämma den optimala DSS-koncentrationen och undvika övertvärbindning exponerade vi först cellerna för 5, 2,5 och 1 mM DSS under 5, 10, 5 respektive 30 minuter och analyserade lysaten med Coomassie-färgad SDS-PAGE (data visas inte).Cellysat verkar vara starkt tvärbundna vid den lägsta koncentrationen och vid den kortaste tidpunkten.Därför titrerades DSS till 1, 0,5 och 0,1 mM under 5 minuter (Figur 1B).Optimal tvärbindning observerades med 0,5 mM DSS under 5 minuter, och dessa betingelser valdes för celler behandlade med IFNa.Dessutom visar figur IC en Western blöt utförd med användning av p53 (DO-1) antikroppen för att bedöma graden av proteintvärbindning.
Flo-1-celler behandlades med 10 ng/ml IFNa under 24 timmar innan tvärbindningsmedlet tillsattes.Tvärbundna celler lyserades därefter genom tvåstegsproteolys och proteiner bearbetades med FASP (Fig. 2)24,25.Tvärbundna tryptiska peptider analyserades med masspektrometri (Fig. 2).MS/MS-spektra matchas sedan till proteinsekvensen och kvantifieras med MaxQuant26,27.Tvärlänkade peptider identifierades från de erhållna spektra med hjälp av SIM-XL-programmet, och individuella föreningar kombinerades till ett komplext nätverk med användning av pipelines för xQuest28 och SIM-XL29 öppen källkod (Fig. 2).SIM-XL identifierar protein-protein-interaktioner, interna kedjor och individuella kedjor i enkla eller komplexa proteinblandningar och tillhandahåller skript för att visualisera interaktioner i proteinstrukturer.Dessutom rangordnar den varje korsreferens som ett ID-poäng enligt MS/MS29-spektrumkvaliteten.Flera mycket tillförlitliga protein-protein-interaktioner och komplex har identifierats, och en ny uppsättning interaktioner har undersökts ytterligare med hjälp av co-immunoprecipitation och konformationsförändringar av komplex med hjälp av molekylär dynamik (MD)-modellering (Fig. 2) 30, 31.
Schematisk översikt av CLMS-metoden.Flo-1-celler behandlades med 10 ng/ml IFNa under 24 timmar följt av in situ proteintvärbindning med användning av DSS följt av cellys och trypsinisering.Tvärbundna prover analyserades med användning av en Orbitrap-masspektrometer och togs ytterligare prover för fragmentering av peptidprekursorer under LC-MS/MS.Två länkade peptider identifierades från de erhållna spektra med hjälp av Spectrum Recognition Machine av Crosslinked Peptides (SIM-XL)-programmet, och alla föreningar kombinerades till ett komplext nätverk med hjälp av beräkningspipelines.Filtrera bort lågkonfidensinteraktioner baserat på falska positiva värden (FDR).Flera nya high-fidelity protein-protein-interaktioner bekräftades ytterligare med hjälp av co-immunoprecipitation, och konformationsförändringar i komplexen undersöktes med hjälp av molekylär dynamik (MD)-modellering.
Totalt ~30 500 och ~ 28 500 peptider detekterades med MaxQuant i ostimulerade respektive stimulerade IFNa-prover (kompletterande tabell S1, Fig. 3A).Peptidlängdsfördelningen i båda fallen visade en högre andel större peptider, vilket indikerar närvaron av tvärbundna peptider (Fig. 3B, C).Dessutom fanns en större andel större peptider i intervallet 40–55 i IFNa-behandlade prover (Fig. 3C).Proteinkartläggning mot log2-intensitet visade att klassiska interferonstimulerade proteiner var vanligast jämfört med obehandlade prover, inklusive MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 och HLA-F (Figur 3D).Analys av vägar för proteiner mer än trefaldigt berikade som svar på IFNa-behandling med hjälp av Reactome-vägdatabasen visade att MHC-I-medierad antigenpresentation och bearbetning var den mest dominerande vägen (Figur 3E).I enlighet med tidigare rapporter var antivirala svar medierade av OAS och ISG15 samt IFNa/β och cytokinsignalering bland de aktiverade vägarna.Dessutom identifierades lysin- och serinspecifika proteintvärbindningar från de ursprungligen förvärvade MS/MS-spektra med SIM-XL.En nyligen genomförd studie rapporterade 104 ISG som spänner över 20 virus från 9 virusklasser genom metaanalys av individuella ISG-överuttrycksstudier i 5 celltyper9.Men för att övervinna de beräkningsmässiga begränsningarna för screening av stora datamängder började vi med en mindre datauppsättning för att utforska möjliga interaktioner mellan listan över IRDS-gener som rapporterats av Padaria et al., varav de flesta är ISG.
Identifiering av differentiellt uttryckta tvärbundna proteiner som svar på IFNa (data erhållna från MaxQuant).(A) Venn-diagram som representerar antalet vanliga och exklusiva peptider som identifierats i IFNα14-behandlade och obehandlade Flo-1-prover.Peptidlängdsfördelning av obehandlade (B) och IFNa-behandlade (C) tvärbundna prover.(D) Värmekarta som representerar log2 (LFQ-intensitet) mellan obehandlade och IFNa14-behandlade Flo-1-celler.Den vänstra panelen visar de proteiner som är mest aktivt aktiverade i närvaro av IFNa.(E) Histogram som representerar de 20 stora anrikningsvägarna efter IFNa-behandling.Reactome pathway-databasen analyserade mer än fyrfaldiga förändringar i uppreglerade IFNa-responsiva proteiner.
Interferon-medierad ISG-stimulering är väl dokumenterad, men på molekylär nivå är det dåligt förstått hur dessa proteiner kulminerar i ett brett spektrum av biologiska funktioner.Vi undersökte proteininteraktioner med en hög grad av förtroende mellan kända ISG:er.Intressant nog identifierade vi ett nätverk inklusive MX1-, USP18-, ROBO1-, OAS3- och STAT1-proteiner som bildar ett stort komplex som svar på IFNa-behandling (Figur 4, Tabell S2) 32,33,34.Viktigast av allt, dessa interaktioner hittades i alla triplikat behandlade med IFNa och hittades inte i obehandlade prover, vilket tyder på att de bildades specifikt som svar på IFNa-behandling.Det är känt att STAT1 transkriptionellt reglerar uttrycket av dessa ISG, men dess interaktion med ISG på proteinnivå har inte studerats.Kristallstrukturen för STAT1 visade att dess spiralformade domän (CCD) inte är involverad i interaktionen med DNA eller protomerer under bildandet av dimerer35.Dessa α-helixar bildar en spiralformad helixstruktur som ger en övervägande hydrofil ytarea för att interaktioner ska kunna inträffa 35 .I våra CLMS-data observerade vi att de flesta av interaktionerna med STAT1 inträffade i SH2-domänen före CCD, länkdomänen eller den C-terminala svansen (resterna 700-708) (Figur 4A).En tidigare studie rapporterade att USP18 binder till CCD och DNA-bindande domän (DBD) av STAT2 och rekryteras till subenheten av typ I-interferonreceptorn IFNAR2 för att förmedla hämning av typ I-interferonsignalering 24 .Våra data visade också att den katalytiska domänen USP18 interagerar med STAT1 DBD (Figur 4A, D), vilket tyder på att både STAT1 och STAT2 kan spela en roll för att locka USP18 till IFNAR2.
Protein-protein ISG-nätverk identifierat i tvärbundna celler behandlade med IFNa.(A) 2D-interaktionsdiagram som visar protein-protein-interaktioner (genererade i SIM-XL-programmet), med linjer som representerar intermolekylära interaktioner (tvärbindningsgränsen satt till 3,5).Domäner med olika identiteter markeras med sin färg32: MX1-domän, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) och GED (569–660).OAS3-domäner: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) och OAS1_C (903-108).Domän ROBO1, Ig_3 (67–151), I-set (170–258), I-set (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) och fn3 (777–864).STAT1-fält: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) och STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Cirkulär tittare av tvärbundna proteiner (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 och STAT1) med interaktioner och interaktioner märkta i blått respektive rött.Tvärbindningströskeln sattes till 3,5.Punktdiagram indikerar STAT1-interaktionsställen med MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) och OAS3 (F), såväl som K- eller S-interaktionsställen mellan de två peptiderna.I figuren är tvärlänkspoängtröskeln satt till 3,0.(G) Olika interaktionsställen mellan STAT1 och OAS3 DI-domäner överlagrade på deras proteinstrukturer i PyMol (PyMOL molecular graphics system, version 2.0 Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb-id: 1bf533) och OAS3 (pdb-id: 4s3n34).) program.
Två isoformer av USP18 har beskrivits hos människor, ett fullängdsprotein som övervägande är lokaliserat i kärnan och en isoform utan en N-terminal domän, USP18-sf, som är jämnt fördelad i cytoplasman och kärnan 36 .Dessutom förutspåddes N-terminalen vara ostrukturerad och kräver inte isopeptidasaktivitet eller ISG1537-bindning.De flesta av interaktionerna som identifierats i vår studie var lokaliserade vid proteinets N-terminal, vilket tyder på att dessa interaktioner involverar fullängds USP18 (Figur 4A, D) och därför sannolikt förekommer i kärnan.Dessutom indikerar våra data också att N-terminalen är specialiserad för protein-till-protein-interaktioner.IFNAR2-bindningsstället är beläget mellan resterna 312-368, och i synnerhet binder inget av proteinerna i komplexet till denna region (Fig. 4A) 37,38.Dessa data tillsammans indikerar att den IFNAR2-bindande domänen uteslutande används av receptorproteinet.Dessutom visade sig endast OAS3 och ROBO1 vara associerade med domäner uppströms om N-terminalen och IFNAR2-bindningsstället (Figur 4A).
ROBO1 tillhör immunglobulin (Ig) superfamiljen av transmembrana signalmolekyler och består av fem Ig-domäner och tre fibronektin (Fn)-domäner i den extracellulära regionen.Dessa extracellulära domäner följs av en membranproximal region och en enkel transmembranspiral 39. En ostrukturerad intracellulär region är belägen vid C-terminalen och innehåller konserverade sekvensmotiv som medierar effektorproteinbindning39.Regionen som sträcker sig från aminosyror ~1100 till 1600 är mestadels oordnad.Vi fann att MX1 interagerar med ROBO1 genom Ig, Fn och intracellulära domäner, medan de flesta interaktioner med STAT1 sker mellan dess CCD, linkerdomän och C-terminalen av ROBO1 (Fig. 4A, E).Å andra sidan var interaktioner med DI-, DIII- och OAS3-linkerregioner fördelade över hela ROBO1-proteinet (Fig. 4A).
Proteinfamiljen oligoadenylatsyntas (OAS) accepterar och binder intracellulärt dubbelsträngat RNA (dsRNA), genomgår konformationsförändringar och syntetiserar 2',5'-kopplade oligoadenylater (2-5 As) 40 .Det visade sig att bland de tre OAS:erna uppvisar OAS3 den högsta affiniteten för dsRNA och syntetiserar den minsta mängden 2-5 As, vilket kan aktivera RNase L och därigenom begränsa viral replikation 41 .OAS-familjen består av polymeras beta (pol-β)-liknande nukleotidtransferasdomäner.Tidigare forskning har visat att den katalytiska aktiviteten hos den C-terminala domänen (DIII) är beroende av den dsRNA-bindande domänen (DI), som krävs för aktiveringen av OAS342.Vi observerade att DI- och DII-domänerna i OAS3 interagerar med CCD och en liten korsningsregion mellan SH2 och STAT1 TAD (Figur 4A, F).Överlagring av olika tvärbindningsställen på proteinstrukturen avslöjade en interaktion mellan β-arket och DBD STAT1-slingan och en öppen ficka eller hålighet bildad av resterna 60–75 i DI-domänen av OAS3 (Fig. 4G).Orienteringen av proteinerna i komplexet indikerade också att ingen av interaktionerna med OAS3 störde DNA-bindningsförmågan hos dess DI-domän (Fig. S1A).Dessutom interagerar den N-terminala domänen av GTPase MX1 omfattande med DI- och DIII-domänerna i OAS3 (Fig. 4A).Vi observerade också en interaktion mellan OAS1 och MX1 i alla tre IFNa-behandlade repetitioner, där en enda OAS1-domän (även katalytiskt aktiv) interagerade med alla tre MX1-domäner (Figur S2A, B).
MX-proteiner är en del av en stor familj av dyneinliknande GTPaser som innehåller en N-terminal GTPas-domän som binder och hydrolyserar GTP, en intermediär domän som förmedlar självmontering och en C-terminal leucinblixtlås som fungerar som en GTPas (LZ) ).domän effektor domän25,43.MX1 binder till underenheter av virala polymeraser för att blockera transkription av den virala genen43.En tidigare rapporterad jäst två-hybrid screening visade att PIAS1-associerad MX1 hämmar STAT1-medierad genaktivering genom att blockera DNA-bindande aktivitet och har även SUMO E344,45 ligasaktivitet.Här visar vi att MX1 binder till STAT1 (Figur 4C, D), men hur denna interaktion påverkar STAT1-medierad genaktivering som svar på IFNa behöver ytterligare studier.Dessutom fann vi också att MX1 interagerade med IFIT3 och DDX60 i alla tre IFNa-behandlade upprepningar (Fig. S2C).
DDX60 är ett IFN-inducerat cytoplasmatiskt helikas som tidigare har rapporterats spela en roll i RIG-I-oberoende nedbrytning av viralt RNA46.Den interagerar med RIG-I och aktiverar dess signalering på ett ligandspecifikt sätt 46. DDX60 består av en DEXD/H-Box-helikasdomän och en C-terminal helikasdomän som binder viralt RNA och DNA47.De flesta av dess interaktioner med MX1 och IFIT3 sker inom långa N- och C-terminala regioner utan kanoniska domäner eller motiv (Fig. S2E, F).Emellertid är MX1 ​​också associerad med DEXD/H-Box-helikasdomänen (Fig. S2E).Proteiner i IFIT-familjen har tandemkopior av ett distinkt helix-turn-helix-motiv som kallas tetrapeptidrepetitionen (TPR).IFIT3 visade sig vara en positiv modulator av RIG-I-signalering och därmed en komponent i MAVS-komplexet.Sammantaget tyder våra data på att IFIT3 och DDX60 interagerar främst i regionen mellan TPR 3-6 av IFIT3 och kan spela en roll i RIG-I/MAVS-signalering (Fig. S2F).
Med tanke på att screening av hela proteomet är beräkningsintensivt, screenade vi sedan hela den mänskliga UniProt-databasen för närvaron av en av de IFNa-behandlade upprepningarna.I den här repliken hittade vi flera mycket tillförlitliga interaktionsnätverk för HLA-A.Analys av proteinvägar identifierade av MS/MS-spektra visade att MHC-I-baserad antigenbearbetning och presentation är den huvudsakliga vägen inducerad av interferon (Fig. 3D).Därför fokuserade vi på att studera proteininteraktionerna mellan MHC-I-molekyler med en hög grad av tillförsikt i alla tvärbundna prover.HLA består av α1-, α2- och α3-domäner och lätta kedjor, och mikroglobulin β2 (β2m) är ett konstant chaperonprotein49.När HLA väl har monterats i det endoplasmatiska retikulumet är HLA instabilt i frånvaro av peptidligander50.Det peptidbindande spåret bildas av de mycket polymorfa och ostrukturerade α1- och α2-domänerna i icke-peptidform och den relativt mindre polymorfa α351-domänen.I närvaro av IFNa upptäckte vi två HLA-A-komplex: en interagerar med HMGA1 och H2B (Figur 5, Tabell S3) och den andra interagerar med MDN1, LRCH4 och H2B (Figur 6).
IFNa inducerar ett HLA-A-interaktionsnätverk med H2B (H2BFS) och HMGA1.(A) 2D-plot (genererad i SIM-XL-programvara) som visar olika typer av interaktioner i H2B-HLA-A-HMGA1-komplexet: interlink (blå), interlink (röd) och enkellänk (svart)..Domäner med olika identiteter är färgkodade32: H2B (histon; 2–102) och MHC-I (MHC_1; 25–203, grupp C1; 210–290 och MHC_I_C; 337–364).Tvärbindningströskeln sattes till 3,5.Punktdiagram indikerar HLA-A-interaktionsställen med H2B (B) och HMGA1 (C), såväl som K- eller S-interaktionsställen mellan de två peptiderna.I figuren är tvärlänkspoängtröskeln satt till 3,0.(D) Relationer mellan proteiner som visas i strukturerna för H2B-, HLA-A- och HMGA1-proteinerna i PyMOL-programmet.Dessa strukturer modellerades med hjälp av Phyre2-servern (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) och mallstrukturerna för H2B-, HLA-A- och HMGA1-proteinerna var 1kx552, 1kj349 respektive 2eze55.
IFNa inducerar ett HLA-A-interaktionsnätverk med H2B (H2BFS), MDN1 och LRCH4.(A) Intramolekylära (röda) och intermolekylära (blå) tvärbindningar presenterade på en 2D interaktiv karta (genererad i SIM-XL-programvara) med MDN1 representerad som en cirkel.Tvärbindningströskeln sattes till 3,5.Domäner med olika identiteter är färgkodade32: H2B (histon; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, grupp C1; 210–290 och MHC_I_C; 337–364) och LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) och CH (535–641)).(B) Relationer mellan proteiner som visas i strukturerna för H2B-, HLA-A-, LRCH4- och MDN1-proteinerna i PyMOL-programmet.Dessa strukturer modellerades med hjälp av Phyre2-servern (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) med mallstrukturer 1kx552, 1kj349, 6hlu62 och 6i2665 för proteinerna H2B, HLA-A, LRCH4 och MDN1, respektive.Punktdiagram som visar K- eller S-interaktionsställen för HLA-A med H2B (C), LRCH4 (D) och MDN1 (E).För plotter sattes tvärlänkspoängtröskeln till 3,0.
Förutom att upprätthålla integriteten hos genomet är histon H2B också involverad i regleringen av transkription.H2B-proteinet består av en central histondomän (HFD) bildad av tre α-helixar separerade av loopar och en C-terminal svans 41,52.Det mesta av interaktionen med H2B sker i α1-helixen, vilket ger trimerisering med HFD-heterodimeren (Fig. 5A,B).Även om lysiner är involverade i DNA-bindning, är vissa lysiner också alternativa acetylerings- eller metyleringsställen.Till exempel är resterna K43, K46 och K57 från H2B inte involverade i direkt DNA-bindning, utan är mål för olika post-transkriptionella modifieringar53.På liknande sätt kan resterna K44, K47 och K57 i H2B spela en alternativ roll i närvaro av IFNa, inklusive interaktioner med andra proteiner (Fig. 5A, B).Dessutom aktiverar den extrakromosomala histonen H2B immunsvaret i olika celltyper, och fungerar som en cytosolisk sensor för att detektera dubbelsträngade DNA-fragment (dsDNA) härrörande från smittämnen eller skadade celler54.I närvaro av DNA-virus hämmade H2B-utarmning IFN-β-produktion och STAT154-fosforylering.H2B är också känt för att röra sig in och ut ur kärnan snabbare än andra kärnhistoner54.H2B-interaktioner med MDN1 och LRCH4 observerades också i utvalda obehandlade prover.Vi fann att HLA-A interagerade med H2B i alla tre IFNa-behandlade prover och i ett obehandlat upprepat prov.Dessa data återspeglar H2B:s roll i en alternativ fysiologisk funktion oberoende av transkriptionell reglering.
HMGA1 (high mobility group AT-Hook 1), ett litet nukleoprotein rikt på sjukdomsfrämjande aminosyror, har identifierats i samband med HLA-A.Den har en sur C-terminal svans och tre distinkta DBDs som kallas AT-krokar eftersom de binder till det mindre spåret i den AT-rika regionen i dsDNA55,56.Denna bindning får DNA:t att böjas eller räta ut, vilket tillåter kanoniska transkriptionsfaktorer att komma åt dess konsensussekvens.Den C-terminala svansen tros vara involverad i protein-proteininteraktioner och rekryteringen av transkriptionsfaktorer, eftersom C-terminala deletionsmutanter inte kan initiera transkription57.Dessutom innehåller denna domän flera konserverade fosforyleringsställen som är kända substrat för kinaser 58 .Vi observerade HLA-A- och H2B-interaktioner med HMGA1 utanför den C-terminala domänen, vilket tyder på att den C-terminala domänen huvudsakligen används för transkriptionsfaktorbindning (Fig. 5A, C).HMGA-proteiner konkurrerar med histon H1 för att binda till adapter-DNA, vilket ökar tillgängligheten57.På liknande sätt verkar det troligt att HMGA interagerar med histon H2B längs linker-DNA i konkurrens med histon H1.HMGB1 inducerar uttrycket av HLA-A, -B och -C i dendritiska celler, vilket leder till deras aktivering59, men en interaktion mellan HMG och HLA har inte tidigare rapporterats.Vi fann att HMGA1 interagerar med α1- och α3-domänerna av HLA-A, med de flesta av interaktionerna utanför dess 3 DBD (Figur 5A, C).I våra händer befanns HLA-A vara lokaliserad i kärnan (data visas inte), och med tanke på att H2B och HMGA1 också finns i kärnan, sker denna interaktion sannolikt i kärnan.Specifika addukter uppmätta mellan H2B, HLA-A och HMGA1 visas i figur 5D.
De flesta interaktioner av HLA-A med andra proteiner sker inom dess al- och a2-domäner och den oordnade C-terminala domänen (Fig. 6).I ett av dessa exempel fann vi att HLA-A interagerar med den oordnade N-terminala svansen av LRCH4 (Figur 6A, D).LRCH4 reglerar TLR4-aktivering och LPS-cytokininduktion och modulerar därigenom det medfödda immunsvaret60,61.Det är ett membranprotein med nio leucinrika upprepningar (LRR) och ett kalmodulin (CH) homologimotiv i dess ektodomän, följt av en transmembrandomän (TMD) 60 , 62 .CH-domäner har rapporterats förmedla protein-protein-interaktioner 60 .En sträcka på cirka 300 aminosyror mellan LRR- och CH-domänerna är relativt tillgänglig men oordnad.Baserat på funktionen av oordnade regioner som mediatorer av protein-proteinnätverk och vesikulär transport 63, fann vi att de flesta proteininteraktioner inträffar i oordnade regioner.Interaktioner med MDN1 var fördelade över hela proteinets längd, inklusive LRR1, LRR6, CH-domänerna och slumpmässiga regioner, medan H2B huvudsakligen band till CH-domänen (Fig. 6A, B).Noterbart inkluderade ingen av interaktionerna TMJ, vilket tyder på specificiteten hos CLMS-metoden (Figur 6A, B).
MDN1 har också identifierats som en del av HLA-A-proteinnätverket (Figur 6A).Det tillhör AAA-familjen av proteiner (ATPaser associerade med olika aktiviteter).Detta är samma N-terminala AAA-domän som organiseras i en hexamerisk ring och tar bort monteringsfaktorn från den ribosomala subenheten 60S 64.verkar likna dynein64,65,66.Dessutom följs den Asp/Glu-rika regionen av MIDAS-domänen (metalljonberoende plats).På grund av den stora storleken på MDN1 (ungefär 5600 aminosyror) och dess begränsade homologi med väl studerade proteiner, är lite känt om dess struktur och funktion hos människor.Vi identifierade HLA-A, H2B och LRCH4 som MDN1-bindningspartner och avslöjade deras orientering som proteinkomplex i PyMol (Fig. 6A, B).Dessa tre proteiner interagerar med AAA-domänen, den dyneinliknande länkdomänen och möjligen MIDAS MDN1-domänen.I en tidigare rapport identifierade affinitetsrening av betesproteiner MDN1 som ett protein associerat med histon H2B67.Dessutom rapporterade en ny studie också en interaktion mellan MDN och HLA-B i HCT116-celler med användning av affinitetsrenad masspektrometri, vilket stöder våra fynd68.Identifieringen av detta komplex i IFNa-behandlade prover antyder en roll för MDN1 i interferonsignalering.
Eftersom HLA-gener är mycket polymorfa, extraherade vi sekvenseringsläsningar som kartlade HLA-A, -B och -C från RNA-sekvenseringsdata från Flo-1-celler (data visas inte).Peptidsekvenser som överensstämmer med sekvenseringsavläsningen avslöjade signifikanta skillnader mellan HLA-A, -B och -C i regioner där tvärbundna peptider var lokaliserade i HLA-A (Figur S3).Dessutom observerade vi inte protein-till-protein-tvärbindning av HLA-B/C-molekyler med H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4-proteiner.Detta tyder på att proteininteraktionen som finns mellan HLA-A, MDN1, LRCH1 och HMGA1 är HLA-A-specifik.Dessutom visade proteomisk analys av icke-tvärbundna prover (tabell S4) att HLA-A har högre sekvenstäckning jämfört med HLA-B eller HLA-C.Peptiderna identifierade för HLA-A hade hög intensitet i både IFNa-behandlade och obehandlade prover.
För att säkerställa att de interaktioner som identifieras här inte berodde på ospecifik tvärbindning av två proteiner i nära rumslig närhet, bekräftade vi ytterligare två nya HLA-A-interagerande faktorer genom att utföra co-immunoprecipitationsanalyser.HLA-A-interaktioner med endogen MDN1 och H2B detekterades i både IFNa-behandlade och obehandlade Flo-1-celler (Figur 7, Figur S4).Vi bekräftade att HLA-A fångades upp av H2B i immunoutfällningarna och att denna association berodde på IFNa-behandling eftersom HLA-A saknades i immunoutfällningsproverna från obehandlade celler (Figur 7A).Men våra data tyder på att IFNa differentiellt reglerar HLA-A-bindning till H2B och MDN1.IFNa inducerar association mellan H2B och HLA-A, men minskar dess association med MDN1.Vi fann att MDN1 var associerad med HLA-A i kontroller, och tillsatsen av IFNa reducerade denna interaktion oberoende av MDN1-induktion av IFNa (Figur 7B, C).Dessutom fångade HLA-A-immunfällning H2B i A549-celler (Fig. S4), vilket tyder på att denna interaktion är oberoende av celltyp.Sammantaget stödjer dessa resultat interferon-medierade interaktioner av HLA-A med H2B och MDN1.
HLA-A samrenar H2B och MDN1.Representativa endogena H2B (A) och MDN1 (B) immunoblots immunoutfälldes från IFNa-behandlade Flo-1-celler och undersöktes med avseende på de angivna antikropparna.Mus och kanin IgG användes som en negativ kontroll.(C) Relativa mängder (input) av olika antigener avbildas av immunoblots som sonderas mot indikerade antikroppar, p-aktin användes som en laddningskontroll.
De strukturella egenskaperna hos ett av de interferoninducerade mycket tillförlitliga tvärbundna nätverken, H2B-HLA-A-HMGA1, undersöktes.Vi använde molekylär dynamikmodellering som ett alternativt tillvägagångssätt för att förstå konformationsdynamiken hos proteinerna som är involverade i detta komplex (Figur 8).Slutsatser från CLMS-data antyder möjligheten till olika konformationer av H2B-, HLA-A- och HMGA1-proteinerna.Följande potentiella komplex modellerades därför i ett lösningsmedelsmedium: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A och H2B-HLA-A-HMGA1.En initial protein-protein dockningsskärm med användning av MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) föreslog möjliga konformationer som skiljer sig mellan dessa proteiner (Fig. 8A).Visualisering av dockningsproteinkomplexet avslöjade flera interaktioner och möjliga konformationer (Figur 5A, 8).Således visas en möjlig konformation i figur 8A (med märkta tvärbindningar) och den utvärderades ytterligare med användning av MD-modelleringspipeline.Dessutom framhäver bindning av H2B eller HMGA1 till HLA-A den högre affiniteten hos H2B för HLA-A (Fig. 8A).
Konformationell dynamik för möjliga nätverk mellan H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A och H2B-HLA-A-HMGA1-komplexen.(A) Vänster panel är en 2D-karta (genererad i SIM-XL-programvara) över intramolekylära (röda) och intermolekylära (blå) tvärbindningar (tvärbindningsgränsen satt till 3,5).Dessutom är identifierade tvärbindningsrester märkta på strukturerna för H2B-, HLA-A- och HMGA1-proteinerna.De associerade konformationerna av dessa proteiner extraherades med användning av dockningspipelinen implementerad i MOE-paketet.Den nedre vänstra panelen visar de olika möjliga konformationerna av H2B-HLA-A- och HMGA1-HLA-A-komplexen med olika protein-proteinbindande affiniteter (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Standardavvikelse (RMSD) för atompositioner (exklusive väteatomer) för varje proteinstruktur.(C) Intermolekylära protein-proteinvätebindningsinteraktioner från olika simulerade komplex med hänsyn till specifika interaktioner med varaktighet ≥ 10 ns.H-bindningsdonator-acceptor cutoff-avståndet sattes till 3,5 Å, och donator-H-acceptor cutoff-vinkeln sattes till ≥ 160°–180°.(D) Märkta rester som bildar HLA-A-protein-proteininteraktioner med sina respektive partners, som sträcker sig över ≥ 20 ns, extraherade från dummy-HLA-A-H2B- och HLA-A-HMGA1-komplex.Proteinstrukturer representerar en medelstruktur på 100 ns MDS.(E) Interaktioner mellan HLA-A-H2B och HLA-A-HMGA1-komplex jämfört med interaktioner spårade av H2B-HLA-simulering över 100 ns baserat på K- eller S-interaktionsstället mellan de två peptiderna.Komplex /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Tröskelvärdet för utvärdering av tvärbindningar sattes till 3,0, och specifika interaktioner från MDS som tog ≥ 10 ns togs i beaktande.Proteinstrukturer visualiserades med hjälp av paketen BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, USA) och Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).
Stabiliteten av HLA-A-molekyler över tid (standardavvikelse; RMSD eller standardavvikelse; RMSF) indikerade att närvaron av H2B- eller HMGA1-proteiner i komplexen stabiliserade HLA-A (Figur 8B, Figur S5).HMGA1-proteinet binder tätt till B2M-stället för HLA-A, vilket inducerar stabiliteten hos HLA-A-aminosyrorna i HLA-A-HMGA1- eller H2B-HLA-A-HMGA1-komplexet (Figur 8B, Figur S5).i synnerhet befanns HLA-rester ~60-90 och ~180-210 vara mindre flexibla i närvaro av H2B (FIG. 8B).H2B och HMGA1 visade bättre bindning till HLA-A i H2B-HLA-A-HMGA1-komplexet jämfört med HLA-A-bindning till H2B eller HMGA1 enbart (Figur 8C, D; Tabell S5).Rester involverade i vätebindning (MD-modellerad hög beläggning ≥ 10 ns) sammanfaller med CLMS-interaktionsställen (K- eller S-rester) i komplexet, vilket tyder på att de interaktioner som identifieras av CLMS är mycket tillförlitliga.Tillförlitlighet (Fig. 8E).I CLMS- och MD-modellering befanns HLA-A-rester mellan cirka 190-210 och cirka 200-220 aminosyror binda H2B respektive HMGA1 (FIG. 8E).
Protein-protein-interaktioner bildar dynamiska strukturella nätverk som förmedlar intracellulär kommunikation som svar på vissa stimuli.Eftersom många proteomikmetoder upptäcker förändringar i den övergripande steady state-nivån för ett protein, kräver protein-proteininteraktionsdynamik ytterligare verktyg för att fånga bindningsgränssnitt, och CLMS är ett sådant verktyg.Interferonsignaleringssystemet är ett cytokinnätverk som tillåter celler att svara på en rad miljöpatogena och inneboende patologiska signaler, som kulminerar i induktionen av undergrupper av interferon-inducerbara proteiner.Vi tillämpade CLMS för att avgöra om nya protein-protein-interaktioner kunde identifieras bland en panel av interferon-inducerade proteiner.Global proteintvärbindningsanalys i en interferon-responsiv Flo-1-cellmodell användes för att fånga proteinkomplex.Extraktion av tryptiska peptider från icke-tvärbundna och tvärbundna celler möjliggör peptidräkning, anrikning av vägen och peptidlängdsfördelning med definierad LFQ-intensitet.Kanoniska interferon-inducerbara proteiner identifierades som en positiv intern kontroll, medan nya intermolekylära och intramolekylära tvärbundna addukter av kanoniska interferon-inducerbara proteiner som MX1, UP18, OAS3 och STAT1 observerades.Olika strukturella egenskaper och interaktioner i funktionsområden har undersökts.
En interaktion mellan HLA-A, MDN1 och H2B detekterades genom immunblotting i Flo-1- och A549-celler behandlade och obehandlade med IFNa.Våra resultat visar att HLA-A komplexbinder med H2B på ett IFNa-beroende sätt.Vårt arbete representerar en intressant väg för ytterligare utforskning av samlokaliseringen av dessa två komplex.Det skulle också vara intressant att utöka CLMS-metoden till en panel av cellinjer för att identifiera celltypsoberoende interferonmedierade proteininteraktioner.Slutligen använde vi MD-modellering som ett alternativt tillvägagångssätt för att förstå konformationsdynamiken hos proteiner som är involverade i H2BFS-HLA-A-HMGA1-komplexet, som spårade intramolekylära och intermolekylära korssamtal.Slutsatser från CLMS-data antyder möjligheten till olika konformationer av H2BFS-, HLA-A- och HMGA1-proteinerna.De möjliga olika konformationerna mellan dessa dockningsproteinkomplex avslöjade flera interaktioner liknande de som observerades i CLMS-datauppsättningen.En av de främsta styrkorna med vår metod är att den möjliggör enkel identifiering av interagerande mycket polymorfa gener som HLA, så det kommer att vara intressant att studera interaktioner av HLA-haplotypspecifika proteiner som annars är svåra att studera.Sammantaget visar våra data att CLMS kan användas för att utöka vår förståelse av interferoninducerade signalnätverk och ge en grund för att studera mer komplexa intercellulära system i tumörmikromiljön.
Flo-1-celler erhölls från ATCC och hölls i DMEM (Gibco) kompletterat med 1% penicillin/streptomycin (Invitrogen), 10% fetalt bovint serum (Gibco) och lagrades vid 37°C och 5% CO2.Inkubation.Celler odlades till 70-80% konfluens innan de behandlades med IFNa14 (tillverkat av Edinburgh Protein Production Facility).Alla andra kemikalier och reagens köptes från Sigma Aldrich om inget annat anges.
Flo-1-celler odlades i plattor med 6 brunnar och nästa dag behandlades cellerna med 10 ng/ml IFNa14 under 24 timmar till ungefär 80 % sammanflytning.Celler tvättades tre gånger med PBS och ligerades med nyberedd DSS (Thermo Fisher Scientific) (upplöst i DMSO) i PBS under 5 minuter vid 37°C till en slutlig koncentration av 0,5 mM.DSS-tvärbindningsreaktionen ersattes med PBS och kvarvarande DSS släcktes genom tillsats av 20 mM Tris (pH 8,0) i PBS under 15 min vid 37°C.Celler uppsamlades genom skrapning och uppsamlades i lågbindande rör (Axygen).
Cellpelleten lyserades med 300 µl urealysbuffert (8 M urea, 0,1 M Tris, pH 8,5) under 30 minuter vid rumstemperatur med tillfällig skakning.Alla centrifugeringssteg utfördes vid 14 000 xg vid 8°C.Centrifugera lysatet i 10 minuter och överför supernatanten till ett nytt rör.De återstående klara partiklarna löstes i 150 μl av den andra lyseringsbufferten (2 M urea, 2 % (vikt/volym) SDS (natriumdodecylsulfat)) i 30 minuter eller mer tills en homogen vattenlösning erhölls.Lysatet centrifugerades under 20 minuter och supernatanten blandades med lysatet som erhölls i föregående steg.Proteinkoncentrationer utvärderades med användning av Micro BCA-analysen (Thermo Fisher Scientific) enligt tillverkarens instruktioner för mikroplattprocedurer.Proverna frystes snabbt i flytande kväve och förvarades vid -80°C.
Ungefär 100 μg lösligt tvärbundet protein bearbetades med användning av ett modifierat filtreringsprovförberedelseprotokoll (FASP) som beskrivs av Wisniewski et al.69 Kortfattat tvärbinds proteinet med 200 µl ureabuffert (8 M urea i 0,1 M Tris, pH 8,5), virvlas och halveras.Alla centrifugeringssteg utfördes vid 14 000 xg vid 25°C.Den första hälften av det tvärbundna proteinlysatet överfördes till en 10 kDa Microcon centrifugalfilteranordning utrustad med ett Ultracel-10-membran (Merck), följt av centrifugering på filtret under 25 minuter.Lägg sedan till den andra hälften av proteinet till filtret och upprepa samma steg.Proteinåtervinning utfördes genom att tillsätta 100 μl 17 mM tris(2-karboxietyl)fosfinhydroklorid (TCEP) i ureabuffert.Återvinningen omrördes på en termomixer vid 600 rpm under 30 min vid 37°C.Dessutom centrifugerades kolonnen och det reducerade tvärbundna proteinet alkylerades med 100 μl 50 mM jodacetamid i ureabuffert.Alkyleringsreaktionen utfördes vid rumstemperatur under 20 minuter i mörker.Rotera kolonnen, tvätta kolonnens väggar 3 gånger med 100 µl ureabuffert och centrifugera sedan.Samma operation utfördes 3 gånger med 100 μl 100 mM ammoniumbikarbonat.Före trypsinisering, byt ut uppsamlingsröret med ett nytt.Tillsätt smältbuffert innehållande 50 mM ammoniumbikarbonat och 1 µl trypsin utspätt i trypsinbuffert (Promega).Förhållandet mellan trypsin och protein bibehölls vid ca 1:33, och nedbrytningsreaktioner inkuberades över natten vid 37°C i en fuktig kammare.Den tvärbundna peptiden eluerades från filtret genom centrifugering under 25 minuter.Peptidåtervinningen förbättrades genom att tillsätta 50 μl 0,5 M NaCl till filtret, följt av centrifugering i 25 minuter.
C18 Micro Spin-kolonner (Harvard Apparatus) användes för att avsalta tvärbundna tryptiska peptider enligt protokollet beskrivet av Bouchal et al.70 med mindre modifieringar.I korthet aktiverades C18-spinnkolonner med tre tvättar med 0,1 % myrsyra (FA) i acetonitril (AcN) (Merck) och två tvättar med 0,1 % FA.Kolonnen hydratiserades med 0,1 % FA under 15 minuter.Ladda prover i centrifugeringskolonner och tvätta 3 gånger med 0,1 % FA.De avsaltade peptiderna eluerades sekventiellt med en stegvis gradient med användning av 50 %, 80 % och 100 % AcN i 0,1 % FA.Proverna torkades i en SpeedVac Plus-koncentrator (Eppendorf) tills den kvarvarande vätskan helt försvann.De eluerade peptiderna löstes i 100 μl 0,08 % trifluorättiksyra i 2,5 % AcN och koncentrationerna mättes på en NanoDrop 2000 (Thermo Scientific).Ungefär 1 μg tvärbunden peptid per prov injicerades i LC-MS/MS-systemet.
Tvärlänkade peptider separerades på ett UltiMate 3000 RSLCnano LC-system (Thermo Scientific) kopplat till en Orbitrap Exploris 480 masspektrometer (Thermo Scientific).Tvärbundna peptider uppsamlades på en 300 µm ID, 5 mm lång µ-pre-kolonn C18-infångningskolonn packad med C18 PepMap100 sorbent och 5 µm PepMap sorbent (Thermo Scientific).Ladda pumpflödesuppsättningen till 5 µl/min 0,08 % trifluorättiksyra löst i 2,5 % AcN.Tvärbundna peptider separerades på en analytisk sammansmält silikakolonn med en innerdiameter på 75 μm och en längd av 150 mm, fylld med en 2 μm PepMap-sorbent (Thermo Scientific).De mobila faserna A och B bestod av 0,1 % FA i vatten respektive 0,1 % FA i acetonitril.Gradienten börjar vid 2,5 % B och ökar linjärt till 40 % B under 90 minuter, sedan till 90 % B under de följande 2 minuterna.Den mobila faskompositionen hölls vid 90 % B under 10 minuter och minskade sedan linjärt till 2,5 % B under 2 minuter.Kolonnen ekvilibrerades vid 2,5 % B under 8 minuter före nästa cykel.Tvärbundna peptider eluerade från den analytiska kolonnen joniserades i en nanoelektrosprayjoniseringskälla (NSI) och injicerades i en Exploris 480 masspektrometer (Thermo Scientific).
Orbitrap Exploris 480 masspektrometer fungerade i positiv datakorrelationsläge.En fullständig skanning utfördes i sektionsläge med en upplösning på 120 000 med intervallinställningar från m/z 350 Th till m/z 2000 Th.Det normaliserade AGC-målet sattes till 300 % med en maximal ingångstid på 50 ms.Monoisotopisk toppdetektion har etablerats för peptider.Parametern för begränsningsrelaxation är satt till sann om för få prekursorer hittas.Den minsta jonstyrkan för prekursorn sattes till 5,0e3 och prekursorladdningstillstånd upp till +8 inkluderades i experimenten.
Cykeltiden mellan stora skanningar i datakorrelationsläge sattes till 2,5 sekunder.Dynamisk massuteslutning sattes till 20 s efter den första fragmenteringen av prekursorjonen.Prekursorisoleringsfönstret sattes till 2 Th.Typen av normaliserad kollisionsenergi med ett fast kollisionsenergiläge valdes i en databeroende MS/MS-skanning.Kollisionsenergi inställd på 30 %.Orbitrap-upplösningen sattes till 15 000 och AGC-målet till 100 %.Den anpassade maximala injektionstiden är inställd på 60 millisekunder.
Innan vi spårade protein-protein-nätverket i tvärbundna prover bearbetade vi råfilerna med MaxQuant-paketet (version 1.6.12.0)26,27 för att identifiera spårbara peptider/proteiner i proverna.Dessutom utfördes liknande proteomanalyser på icke tvärbundna Flo-1-prover behandlade och obehandlade med IFNa.MS/MS-data söktes i den mänskliga databasen UniProt (www.uniprot.org) (uppladdad 12 augusti 2020, innehåller 75 093 poster) med den inbyggda sökmotorn Andromeda27.Sökningen utfördes utan att ange enzymets specificitet och olika modifieringar av deamidering (N, Q) och oxidation (M).Prekursormasstoleranser sattes till 20 ppm och produktjoner till 0,02 Da.Den initiala och maximala massavvikelsen sattes till 10 ppm.Peptidens maximala massa sattes till 4600 Da och sekvenslikheten sattes mellan 7 och 25 aminosyror (aa).Ytterligare statistisk analys utfördes med hjälp av Perseus-programmet (version 1.6.10.45).Proteininnehåll beräknades genom att normalisera proteinets spektrala intensitet (LFQ-intensitet; omärkt kvantifiering)27 och intensitetsvärdena omvandlades till Log2.En hierarkisk klustring av proteiner identifierade av deras peptidintensitet byggdes med användning av pheatmap (v1.0.12)-paketet i R (v 4.1.2).Bananrikningsanalys utfördes med hjälp av Reactome-vägdatabasen för IFNa-behandlade proteiner som var mer än fyra gånger aktiverade jämfört med obehandlade prover.
Identifiering av lysin (K) eller serin (S) specifika kemiska tvärbindningar av proteinkomplex övervakade av LC-MS/MS utfördes med användning av en spektroskopisk identifieringsmaskin (SIM-XL) för tvärbundna peptider (SIM-XL)29.Först undersöktes möjliga interaktioner mellan interferonassocierade (IFN) DNA-skaderesistenssignaturgener (IRDS) med användning av IRDS-proteindataset som beskrivs i Padariya et al.28.Screening av alla tillstånd och upprepningar av hela den mänskliga UniProt är beräkningsintensiv, så hela den mänskliga UniProt-databasen (www.uniprot.org) (nedladdad 12 augusti 2020, innehåller 75 093 poster) mot IFNα-behandlade upprepningar.Ett av filtren för interaktioner med hög förtroende.Dessa erhållna interaktioner med hög signifikans utökades och testades under alla upprepningar och förhållanden.
I SIM-XL användes DSS för tvärbindaren (XL) och XL viktförskjutning och modifiering av viktförskjutning sattes till 138,06 respektive 156,07.Följande tvärbindningsreaktionsställen beaktas: KK, KS och KN-TERM, utan reporterjoner.Både prekursor och fragment ppm sattes till 20 och Xrea-tröskeln sattes till 0,15.Trypsin ansågs vara helt specifikt, och en högenergi C-fälla (HCD) fragmenteringsmetod implementerades.XCorrs dynamiska DB-reduktionströskel och det minsta antalet peptider för dynamisk DB-reduktion sattes till 2,5 respektive 2.Andra parametrar är: monoisotopsannolikhet och toppkoincidensgräns, minst 4 AA-rester per sträng och maximal strängladdning och 3 maxima för missade splittringar.De resulterande sydda 2D-kartorna analyserades i (SIM-XL) och den grafiska representationen xQuest28 användes för att bygga 2D-kartorna.Proteintvärbindningar på proteinstrukturer tillhandahålls i PyMol (PyMOL Molecular Graphics System, version 2.0 Schrödinger, LLC).
Proteinmodellstrukturer skapades med hjälp av Phyre2-servern (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 med hjälp av principerna för homologimodellering och implementering av "Hidden Markov Method".Phyre2 genererar modellstrukturer baserade på sekvensanpassning med kända proteinstrukturer.För H2BFS-, HLA-A-, HMGA1-, LRCH4- och MDN1-proteiner användes mallstrukturerna 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 och 6i2665.Dessutom beaktades strukturen för AlphaFold71 MX1, UBP18 och ROBO1.Proteinstrukturen visualiserades med hjälp av BIOVIA Discovery Studio Visualizer-paketet (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, USA) och Molecular Operating Environment-paketet (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada).