ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplexsvetsade rör för kemisk industri kemisk komponent, Brist på SPECC1L leder till ökad stabilitet hos skarvade leder och minskad utsöndring av kraniala nervceller.

Tack för att du besöker Nature.com.Du använder en webbläsarversion med begränsat CSS-stöd.För bästa upplevelse rekommenderar vi att du använder en uppdaterad webbläsare (eller inaktiverar kompatibilitetsläge i Internet Explorer).Dessutom, för att säkerställa löpande support, visar vi webbplatsen utan stilar och JavaScript.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplexsvetsade rör för kemisk industri

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.är en ledande tillverkare som är specialiserad på sömlösa rör av rostfritt stål, ljusglödgade rör, sömlösa lindade rör etc.För att underlätta för kunderna har vi även svetsade rör och rör.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.har den mest avancerade produktions- och testutrustningen.Vi kan helt tillfredsställa ditt krav.Enligt mycket strikt standard har rör som produceras av oss alltid korrekt OD och WT tolerans.Toleranskontrollen är strikt i enlighet med tillverkande standarder.Våra produkter är alltid nöjda med kunderna.Kunder som köpte våra produkter skapade större vinster.
a) OD (Ytterdiameter): 3,18 mm till 101,6 mm
b) WT (väggtjocklek): 0,5 mm till 20 mm
c) Längd: Enligt kundens krav
d) Standarder: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 osv
e) Processmetod: ERW, EFW etc

Reglage som visar tre artiklar per bild.Använd bakåt- och nästaknapparna för att flytta genom bilderna, eller skjutkontrollknapparna i slutet för att flytta genom varje bild.
De kraniala neural crest-cellerna (CNCC) sjunker av de embryonala neurala vecken och migrerar till svalgbågarna, som bildar de flesta av mellanansiktsstrukturerna.CNCC-dysfunktion spelar en viktig roll i etiologin för orofacial spalt, en vanlig medfödd missbildning.Heterozygota SPECC1L-mutationer har hittats hos patienter med atypiska och syndromiska klyftor.Här rapporterar vi förbättrad färgning av kanoniska adhesive junction (AJ) komponenter, β-catenin och E-cadherin i odlade SPECC1L knockdown-celler, och elektronmikrofotografier visar apikal-basal diffusion av AJ.För att förstå rollen av SPECC1L i kraniofacial morfogenes skapade vi en Specc1l-defekt musmodell.Homozygota mutanter är embryonala dödliga och uppvisar försämrad neuralrörstängning och CNCC-laminering.AJ-proteinfärgning ökar i mutanta neurala veck.Denna AJ-defekt överensstämmer med en defekt i CNCC-delaminering, som kräver AJ-upplösning.Dessutom har Specc11-mutanter minskad PI3K-AKT-signalering och ökad apoptos.In vitro var mild hämning av PI3K-AKT-signalering i vildtypsceller tillräcklig för att inducera AJ-förändringar.Viktigt är att AJ-förändringar inducerade av SPECC1L knockdown kan vändas genom aktivering av PI3K-AKT-vägen.Sammantaget tyder dessa data på att SPECC1L, som en ny regulator av PI3K-AKT-signalering och AJ-biologi, krävs för neuralrörsstängning och CNCC-stratifiering.
Cranial neural crest-celler (CNCC) lokaliseras till den dorsala neuroektodermen och lösgörs från neuroepitel i de utvecklande neurala vecken genom en process som involverar epitel-mesenkymal övergång (EMT)1,2,3.Premigrerande epiteliala CNCC stör intercellulära korsningar och blir migrerande mesenkymala CNCC som fyller den första och andra svalgbågen och bildar det mesta av kraniofacialbrosket.Således störs gener som reglerar CNCC-funktionen ofta i etiologin av kraniofaciala medfödda anomalier såsom orofaciala klyftor, som oftast påverkar 1/800 födslar enbart i USA.En av de medfödda missbildningarna8.
Delaminering av CNCC sammanfaller med stängningen av det främre neuralröret mellan 8,5 och 9,5 dagars embryonal utveckling hos möss.Mutanter av ett antal mus-orofacial spalt-associerade gener uppvisar också någon form av neuralrörsdefekt, inklusive Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 och Pdgfrα12.Emellertid kan processerna för neuralrörstängning och CNCC-stratifiering betraktas som oberoende, eftersom Splotch-mutantmusen (Pax3) uppvisar defekter i neuralrörsförslutning utan någon effekt på CNCC-stratifiering eller migration 13,14.Ytterligare musmodeller med defekter i CNCC-dissektion och neuralrörsstängning kommer att hjälpa till att avgränsa den gemensamma molekylära grunden för dessa två processer.
Isolering av CNCC från neuroepitelceller kräver upplösning av adhesive junctions (AJs), som är sammansatta av proteinkomplex innehållande bland annat E-cadherin, β-catenin, α-E-catenin och α-aktinin associerat med aktinfilament 2 Överuttrycksstudier E-cadherin i neurala veck visade en minskning eller fördröjning av CNCC-delaminering.Omvänt resulterar undertryckande av E-cadherin i tidig stratifiering15,16.Många av faktorerna som förmedlar EMT under CNCC-stratifiering är transkriptionsfaktorer (AP2α, Id2, FOXD3, SNAIL, TWIST, SOX10) och extracellulära matrix (ECM) ommodellerande proteiner såsom matrismetalloproteinaser (MMP), men CNCC är direkta cytoskelettala AJ-regulatorer ännu inte känt.PI3K-AKT-vägen är känd för att motverka E-cadherinnivåer, främst från cancerforskning17.Nyligen genomförda studier har visat att förlust av PDGFα-baserad PI3K-AKT-signalering hos möss leder till kraniofaciala abnormiteter, inklusive gomspalt och neuralrörsdefekter12.Förhållandet mellan PI3K-AKT-vägen och AJ-stabilitet vid CNCC-stratifiering är dock oklart.
Vi har tidigare identifierat SPECC1L som den första muterade genen hos två personer med en svår klyfta som sträcker sig från munnen till ögat, känd som oblique cleft (ObFC) eller Tessier IV18 cleft.SPECC1L-mutationer har identifierats i två flergenerationsfamiljer med det autosomalt dominanta Opitz G/BBB-syndromet (OMIM #145410), där drabbade individer uppvisade hyperdistans och läpp-/gomspalt19, och i en familj med Tibi-överdistanssyndrom (OMIM #145420)20 .mer än hälften av fallen av Opitz G/BBB-syndrom är X-kopplade (OMIM #300000) och orsakas av mutationer i MID1-genen, som kodar för protein 22 i det mikrotubuli-associerade cellskelettet.Vi antar att SPECC1L, också ett protein associerat med mikrotubuli och aktincytoskelettet, kan förmedla signalering som krävs för ombyggnad av aktincytoskelett under celladhesion och migration 18 .Genom in vitro- och in vivo-studier beskriver vi nu SPECC1L som en ny regulator av AJ-stabilitet genom PI3K-AKT-signalering.På cellnivå resulterade SPECC1L-brist i en minskning av nivån av pan-AKT-proteinet och en ökning av den apikala-basala dispersionen av AJ, som eliminerades genom kemisk aktivering av AKT-vägen.In vivo visar Specc11-defekt embryon försämrad neuralrörsstängning och minskad CNCC-dissektion.Således fungerar SPECC1L i starkt reglerad celladhesionsbaserad signalering som krävs för normal CNCC-funktion under ansiktsmorfogenes.
För att karakterisera rollen för SPECC1L på cellnivå använde vi den tidigare beskrivna stabila osteosarkomcellinjen U2OS som saknar SPECC1L18.Dessa stabila U2OS-celler med SPECC1L (kd) knockdown hade en måttlig (60–70 %) minskning av nivåerna av SPECC1L-transkript och proteiner, tillsammans med defekter i migration och omorganisation av aktincytoskelettet 18. Däremot en allvarlig övergående minskning av SPECC1L har visat sig leda till mitotiska defekter 23 .Vid ytterligare karakterisering fann vi att våra stabila SPECC1L-kd-celler ändrade morfologi vid en mycket hög grad av konfluens (Figur 1).Individuella kontrollceller och kd-celler vid låg konfluens såg likadana ut (Figur 1A, D).24 timmar efter fusion behöll kontrollceller sin kubformade form (Fig. IB, E), medan SPECC1L-kd-celler förlängdes (Fig. 1C, F).Omfattningen av denna förändring i cellform fångades av in vivo levande avbildning av kontrollceller och kd-celler (film 1).För att bestämma rollen för SPECC1L i konfluenta celler undersökte vi först dess uttryck.Vi fann att SPECC1L-proteinnivåer ökade vid fusion (Figur 1G), medan SPECC1L-transkriptnivåer inte ökade (Figur 1H).Dessutom, när celldensiteten ökade, ackumulerades SPECC1L-protein vid intercellulära gränser (Fig. 2A-E), med ett mönster som överlappar det för membranassocierat β-catenin (Fig. 2A'-E').Med tanke på associationen av SPECC1L med aktincytoskelettet 18,23 antog vi att SPECC1L interagerar med aktinbaserade adhesiva junctions (AJ).
(AF) SPECC1L knockdown-celler (DF) förlängs vid hög konfluens (F) jämfört med kontroll U2OS-celler (AC).Här visas tre av de sex tidpunkterna (T1, T3, T6) som vi valde för olika celldensiteter.(G) Western blot-analys som visar att SPECC1L-proteinet är stabiliserat vid en hög grad av konfluens jämfört med en låg grad av konfluens i kontrollceller.Western blöt av SPECC1L visar det förväntade 120 kDa-bandet och ett band med högre molekylvikt, möjligen post-translationellt modifierat (*).Western blot-analys utfördes under samma betingelser för låg och hög konfluens.Bilder som visar SPECC1L vid låg och hög konfluens togs från samma blöt.Samma blöt avlägsnades och undersöktes på nytt med β-aktinantikropp.(H) Kvantitativ RT-PCR-analys visade inga signifikanta förändringar i SPECC1L-transkriptnivåer.Felstaplar representerar SEM från fyra oberoende experiment.
(AE) Vi valde sex tidpunkter (T1-T6) som representerar en rad celldensiteter för att normalisera cellformanalys och AJ-förändringar i U2OS-celler med SPECC1L knockdown (kd).De första fem av dessa tidpunkter inkluderade enstaka celler (T1), 50-70 % fusion av små cellkluster (T2), fusion utan omformning av kd-celler (T3), omformning av kd-celler (T4) och 24 timmars förändringar.i den bakre formen av kd (T5) celler.SPECC1L-proteinet var övervägande dispergerat i cytoplasman vid T1 (A), men dess ackumulering observerades vid intercellulära gränser vid efterföljande tidpunkter (B–E, pilar).(FJ) β-catenin visar liknande ackumulering vid intercellulära gränser associerade med AJ-komplexet.(A'-E') SPECC1L och β-catenin visar överlappande färgning vid cellgränser vid hög celldensitet (pilar).(F'-J') I SPECC1L-kd-celler verkar β-cateninfärgning normal vid låg celldensitet (F'-H'), men expanderar när cellformen ändras (I', J'; pilar), vilket indikerar att AJ har ändrats.Staplar = 10 µm.
Vi försökte sedan bestämma effekten av SPECC1L-brist på AJ.Vi använde flera AJ-associerade markörer, inklusive de kanoniska komponenterna F-aktin, myosin IIb, β-catenin och E-cadherin24,25,26,27.Aktinstressfibrer ökade i SPECC1L-kd-celler som beskrivits tidigare (Fig. 3A,B) 18 .Myosin IIb associerat med aktinfilament visade en liknande ökning av SPECC1L-kd-celler in vitro (Fig. 3C, D).AJ-associerat β-catenin binder till cadherin vid cellmembranet, vilket visar ett normalt "bikake"-expressionsmönster i kontrollkubocyter (Fig. 3E, G).Intressant nog, i platta bilder med konfokalmikroskopi, visade β-catenin (Fig. 3E, F) och E-cadherin (Fig. 3G, H) färgning på cellmembranet av konfluenta SPECC1L-bristceller framträdande mönster av utökad färgning.Denna expansion av AJ-associerad p-catenin-färgning i kd-celler var mest uttalad vid sammanflöde, men verkade föregå förändringar i cellform (Fig. 2F-J, F'-J').För att bestämma den fysiska karaktären av denna utökade AJ-färgning, undersökte vi cellgränser på den apikala-basala ytan av SPECC1L-kd U2OS-celler genom transmissionselektronmikroskopi (TEM) (Figur 3I, J).I motsats till kontrollceller (Fig. 3I), som hade separata elektrontäta områden som indikerar AJ (pilar), visade kd-celler (Fig. 3J) stora, sammanhängande regioner med hög elektrontäthet som indikerar AJ längs det apikobasala planet..Dessutom, på tvärsnitt, observerade vi omfattande cellmembranveck i kd-celler (Fig. S1A, B), vilket förklarar det utökade mönstret av β-catenin och E-cadherinfärgningsband (Fig. 3F, H).Till stöd för rollen av SPECC1L i AJs, var β-catenin co-immunoprecipiterade med SPECC1L i lysat av konfluenta U2OS-celler (Fig. 3K).Tillsammans med utökad immunfärgning för AJ-markörer överensstämde TEM-analys med vår hypotes att SPECC1L-brist ökar AJ apikal-basal densitet och varians.
(AH) Ökad F-aktinfärgning i kd-celler 48 timmar efter fusion (T6; A, B).Förändrad färgning av myosin IIb associerad med F-aktin (C, D).Det jämna mönstret av β-catenin och E-cadherin membranfärgning i kontrollceller (E, G) förstärktes i SPECC1L-kd (F, H) celler.Staplar = 10 µm.(I–J) Elektronmikrofotografier som observerar den apikala-basala intercellulära korsningen.Kontrollceller visar distinkta elektrontäta regioner som indikerar klibbiga korsningar (I, pilar).Däremot verkade hela den apikala-basala förbindelsen i SPECC1L-kd-celler elektrontät (J, pilar), vilket indikerar ökad densitet och spridning av adhesiva förbindelser.(K) β-catenin samimmunoutfälldes med SPECC1L i konfluenta U2OS-cellysat.Bild tagen från en plats som representerar ett av fyra oberoende experiment.
För att förstå rollen av SPECC1L i kraniofacial morfogenes skapade vi en Specc1l-defekt musmodell med hjälp av två oberoende ES-fällcellinjer, DTM096 och RRH048 (BayGenomics, CA), som representerar intron 1 och Specc1l-transkript fångades vid 15 (Fig. 1) .4A, figur S2).Den genomiska platsen för lockvektorinsättningen bestämdes genom helgenomsekvensering och bekräftades med PCR (Fig. S2).Båda designerna av genfällor möjliggjorde också in-frame fusion av Specc11-lacZ reportrar vid fångst.Därför användes lacZ-uttryck bestämt genom X-gal-färgning som en indikator på Specc11-uttryck.Båda allelerna visade liknande lacZ-expressionsmönster, med DTM096-genfällan i intron 1 som visade starkare uttryck än RRH048 i intron 15 (visas ej).Specc1l uttrycks dock brett, med särskilt starkt uttryck i neurala veck vid E8.5 (Figur 4B), i neuralröret och ansiktsprocesser vid E9.5 och E10.5 (Figur 4C,D) och i lemmar under utveckling vid E10.5 och ögon (Figur 4D).Vi har tidigare rapporterat att SPECC1L-uttryck i den första svalgbågen vid E10.5 var närvarande i epitelet och underliggande mesenchyme18, i överensstämmelse med CNCC-linjen.För att testa SPECC1L-uttryck i CNCC utförde vi E8.5 neurala veck (Figur 4E-J) och E9.5 skallsektioner (Figur 4K-).Vid E8.5 färgade SPECC1L neurala veck intensivt (Fig. 4E, H), inklusive celler färgade med NCC-markörer (Fig. 4G, J).Vid E9.5, SPECC1L (Fig. 4K, N) starkt färgade migrerande CNCC samfärgade med AP2A (Fig. 4L, M) eller SOX10 (Fig. 4O, P).
(A) Schematisk representation av mus Specc11-genen som visar lockvektorinsättning i ES DTM096 (intron 1) och RRH048 (intron 15) cellkloner.(BD) lacZ-färgning av heterozygota Specc1lDTM096-embryon som representerar Specc1l-uttryck från E8.5 till E10.5.NE = neuroektoderm, NF = neuralveck, PA1 = första svalgbågen.(EP) SPECC1L immunfärgning med NCC-markörer AP2A och SOX10 i E8.5 (NF; EJ) neurala veck och E9.5 (KP) skallsektioner.SPECC1L-färgning observerades allmänt i neurala veck E8.5 (E, H; pilspetsar), inklusive celler märkta med AP2A (F, G; pilspetsar) och SOX10 (I, J; pilspetsar).Vid E9.5 färgade SPECC1L kraftigt migrerande CNCC (K, N; pilar) märkta AP2A (L, M; pilar) och SOX10 (O, P; pilar).
Korsning mellan heterozygota Specc1lDTM096/+ och Specc1lRRH048/+-möss visar att de två genfälla-allelerna inte är komplementära och att sammansatta heterozygoter och embryonala homozygoter för endera genfällningsallelen är embryonala dödliga (tabell S1).Mendelska förhållanden indikerade en minskning av överlevnadsgraden för heterozygoter vid födseln (förväntad 1,34 mot 2,0).Vi noterade låg perinatal dödlighet bland heterozygoter, några hade kraniofaciala anomalier (Fig. S3).Den låga penetransen hos dessa perinatala kraniofaciala fenotyper gör det dock svårt att studera deras underliggande patofysiologiska mekanismer.Därför fokuserade vi på den embryonala dödliga fenotypen av homozygota Specc11-mutanter.
De flesta sammansatta heterozygota eller homozygota Specc1lDTM096/RRH048 muterade embryon utvecklades inte efter E9.5–10.5 (fig. 5A–D), och neuralröret stängdes inte anteriort (fig. 5B, D) och stängdes ibland baktill (visas inte) ..Denna kraniala neuralrörsstängningsdefekt var associerad med majoriteten av CNCC-märkta DLX2 kvar i neurala vecken vid E10.5, vilket indikerar ingen dissektion (Figur 5A'-D').För att avgöra om den totala storleken på CNCC också reducerades, taggade vi CNCC-linjer med GFP i våra genfällningslinjer med Wnt1-Cre och ROSAmTmG.Vi strömmar sorterade GFP+ NCC och GFP-(RFP+) icke-NCC från hela embryon.Vid E9.5 förändrades inte andelen flödessorterade GFP-märkta CNCCs signifikant mellan WT och muterade embryon (visas ej), vilket indikerar normal CNCC-specifikation.Därför antog vi att kvarvarande Wnt1-Cre- och DLX2-färgning i exponerade neurala veck (Figur 5B') berodde på defekt CNCC-skiktning, möjligen på grund av ökad densitet eller dispersion av AJ-celler, som ses i SPECC1L-kd-celler.Vi använde NCC-markörerna SOX10, AP2A och DLX2 för att bekräfta närvaron av CNCC i nervvecket (Figur 5E-R).Vid E8.5 observerades neuralveckfärgning för alla tre NCC-markörerna i sektioner av WT (Fig. 5E, G, I) och Speccll-mutant (Fig. 5F, H, J).Vid E9.5, medan NCC-markörer färgade migrerande NCC i WT-sektioner (Fig. 5M, O, Q), observerades kvarvarande NCC-färgning i exponerade neurala veck av Specc1l-muterade embryon (Fig. 5N, P, R).Eftersom SOX10 och DLX2 markerar migrerande CNCC, tyder detta resultat på att SPECC1L-defekta CNCCs uppnår post-migratorisk specifikation men misslyckas med att migrera från neurala veck.
Specc11-brist leder till defekt stängning av neuralröret, delaminering av kraniala nervceller och AJ.
(A, B') E9.5 WT (A) Embryo som bär migrerande kraniala nervceller (CNCC) märkta med Wnt1-Cre (A').Däremot visar Specc11 muterade embryon öppna neurala veck (B), pilspetsar) och CNCCs som inte har migrerat (B', pilspetsar).(C, D') Ljusa fältbilder (C, D') och immunfärgning (C', D') av CNCC-markören DLX2 av E10.5 WT-embryon (C, C') och Specc1l (D, D').I WT E10.5-embryon koloniserar DLX2-positiva CNCC gälbågarna (C', pilar), medan i mutanter kvarstår iögonfallande färgning i de öppna neurala vecken (D', pilar) och i de första farynxbågarna (D', pilar).) med viss färgning (pilar) som indikerar dålig delaminering och migrering av CNCC.ER) Sektioner av WT- och Specc1l-muterade embryon i steg E8.5 (E–L) och E9.5 (M–R) märktes med NCC-markörer SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P) och DLX2 (I, J, Q, R).Vid E8.5 observerades NCC-färgning i vildtyps neurala veck (NF) och mutanta sektioner.Samfärgning av SOX10 och β-catenin i E8.5 WT (K) och mutant (L) avslöjade ökad β-catenin-färgning vid cellgränserna i neurala veck.Vid E9.5 observerades vildtypsfärgning av migrerande CNCC (M, O, Q), medan i mutanter färgade ostratifierade CNCC öppna neurala veck (N, P, R).(S–Z) In vivo AJ-märkningsanalys i koronala sektioner av WT- och Specc11DTM096/RRH048-embryon med E9.5-mutationen.Ett ungefärligt snittplan visas i det övre högra hörnet.I sektioner av mutanta vävnader observerades ökad färgning av F-aktin (S, T) och myosin IIb (U, V).I likhet med in vitro-resultaten i fig. 3 observerades förbättrad membranfärgning för β-catenin (W, X) och E-cadherin (Y, Z) i muterade embryon.(AA-BB) En elektronmikrofotografi av en sektion av ett vildtyps-embryo som ser bortom gränsen för den apikala-basala cellen visar en distinkt elektrontät region som indikerar adhesiva korsningar (AA, pilar).I motsats härtill, i sektioner av Specc11-muterade embryon (BB, pilar), är hela den apikobasala förbindelsen elektrontät, vilket indikerar en ökad densitet och spridning av adhesiva förbindelser.
För att testa vår hypotes att minskad skiktning beror på förändrad AJ, undersökte vi AJ-märkning i exponerade neurala veck av Specc1l mutanta embryon (Fig. 5S-Z).Vi observerade en ökning av aktinstressfibrer (Fig. 5S, T) och en åtföljande ökad lokalisering av myosin IIB-färgning på aktinfibrer (Fig. 5U, V).Viktigt, vi observerade ökad färgning av β-catenin (Fig. 5W, X) och E-cadherin (Fig. 5Y, Z) vid intercellulära gränser.Vi undersökte också β-catenin-färgning av NCC i de neurala vecken av E8.5-embryon (Fig. 5K, L).β-cateninfärgning verkade vara starkare i Specc1l mutanta neurala veck (Fig. 5L och K), vilket tyder på att AJ-förändringar hade börjat.I elektronmikrofotografier av skallsektioner av E9.5-embryon observerade vi återigen ökad diffus elektrontät färgning i Specc1l-muterade embryon jämfört med WT (Fig. 5AA, BB och S1E-H).Sammantaget stödjer dessa resultat våra in vitro-resultat i SPECC1L-kd U2OS-celler och antyder att avvikande AJ-färgning föregår CNCC-stratifiering i våra muterade embryon.
Med tanke på det kända antagonistiska förhållandet mellan AKT-aktivitet och E-cadherin-stabilitet, 17,28 antog vi inblandningen av PI3K-AKT-signalering.Dessutom observerade vi subepidermal blåsbildning i några av våra mutanta embryon som undgick dödlighet (<5%) vid E9.5-10.5 och istället satte sig runt E13.5 (Fig. S3).Subepidermala vesiklar är ett kännetecken för minskad PI3K-AKT-signalering baserat på PDGFRα12.Fantauzzo et al.(2014) rapporterade att störningar av PDGFRα-baserad PI3K-aktivering i PdgfraPI3K/PI3K-muterade embryon resulterar i subepidermala vesiklar, neuralrörsdefekter och fenotyper av gomspalt.Faktum är att nivåerna av pan-AKT och aktiv fosforylerad Ser473-AKT reducerades in vivo i Specc1l mutantvävnader till E9.5 embryonal stopp (Fig. 6A-D).Minskningen av nivåerna av fosforylerad Ser473-AKT kan helt bero på minskningen av nivåerna av pan-AKT in vivo (FIG. 6E) och in vitro (Fig. 6F).En minskning in vitro observerades endast när U2OS-celler var starkt konfluenta med förändringar i cellform och AJ-densitet (Figur 6D).Således tyder våra data på att SPECC1L är en ny positiv regulator av PI3K-AKT-signalering i kraniofacial morfogenes.
(A–E) E8.5 (A,B) och E9.5 (C,D) skallsektioner eller E9.5-lysat från Specc1l muterade embryon (E) som visar nivåer av aktiv fosforylerad S473-AKT och pan-AKT Proteinreduktion , jämfört med kontroll WT.Western blotting utfördes på vildtypslysat och mutantlysat under samma betingelser.Bilderna som visas för SPECC1L togs från en blöt.Samma blöt avlägsnades och undersöktes på nytt med anti-pan-ACT- och p-aktin-antikroppar.Pan-AKT-nivåer i E8.5 neurala veck (A, B) och nivåer av fosforylerad S473-AKT i E9.5 skallsektioner reducerades signifikant.(F) Pan-AKT-nivåer reducerades på liknande sätt i lysat av SPECC1L-kd U2OS-celler skördade vid hög konfluens.Felstaplar representerar SEM från tre oberoende Western blot-kvantifieringar.(GJ) Sektioner av WT-embryon vid E9.5 färgade med KI67 respektive kluvet kaspas 3, som visar cellproliferation (G, G') och liten apoptotisk aktivitet (H, H').Specc11 mutanta embryon visar jämförbar cellproliferation (I), men antalet celler som genomgår apoptos ökar signifikant (J).
Vi undersökte sedan markörer för proliferation och apoptos.Vi observerade ingen skillnad i proliferationen av E9.5-embryon (Fig. 6E, G jämfört med I) med ett proliferationsindex på 82,5 % för WT-mutanter och 86,5 % för Specc1l-mutanter uppmätt med KI67-färgning (p <0,56, Fisher's exakt test).På liknande sätt observerade vi inte någon skillnad i apoptos mätt genom färgning för kluvna kaspas 3 i neurala veck vid E8.5 tills embryostopp (ej visat) (ej visat).Däremot ökade apoptos signifikant i alla E9.5-muterade embryon (Fig. 6F, H och J).Denna totala ökning av apoptos överensstämmer med minskad PI3K-AKT-signalering och tidig embryonal dödlighet29,30,31.
Därefter, för att bekräfta en orsaksroll för PI3K-AKT-signalering i AJ-förändringar i våra kd-celler, ändrade vi kemiskt vägen i kontroll- och kd-celler (Figur 7A-F).Vi använde som markör cellformsförändringsfenotypen som observerades i konfluenta SPECC1L-kd-celler, som vi kvantifierade med hjälp av förhållandet mellan den längsta dimensionen (längd) och motsvarande vertikala dimension (bredd).Ett förhållande på 1 förväntas för relativt runda eller kubiska celler (Figur 7G).Förutom cellformen bekräftade vi också effekten på AJ genom β-cateninfärgning (Fig. 7A'-F').Inhibering av PI3K-AKT-vägen med användning av wortmannin var tillräcklig för att ändra cellform i kontrollceller (Figur 7A, C) och AJ (Figur 7A').PI3K-AKT-aktivatorn SC-79 påverkade inte cellformen (FIG. 7A, E) eller AJ-expansion (FIG. 7A') i kontrollceller.I SPECC1L-kd-celler resulterade ytterligare undertryckande av PI3K-AKT-vägen i ökad apoptos (Fig. 7B, D) och en markant ökning av β-cateninfärgning (Fig. 7B'), i överensstämmelse med våra tunga mutanter in vivo.Viktigt är att aktivering av PI3K-AKT-vägen förbättrade cellformen avsevärt (Figur 7B, F) och AJ-fenotyper (Figur 7B").Förändringar i cellform kvantifierades som cellrundhetsförhållande (CCR) och jämfördes med avseende på signifikans som beskrivits ovan (FIG. 7G).I kontrollceller (fig. 7G, CCR = 1,56) var wortmanninbehandling tillräcklig för att signifikant förändra cellformen (fig. 7G, CCR = 3,61, p < 2,4 × 10-9) i en omfattning liknande den som observerades i SPECC1L.-kd-celler (Fig. 7G, CCR = 3,46).Wortmanninbehandling av SPECC1L-kd-celler (fig. 7G, CCR = 3,60, försumbar) var inte mer signifikant än obehandlade kd-celler (fig. 7G, CCR = 3,46, försumbar) eller wortmanninbehandlade kontrollceller (fig. 7G).CCR = 3,46, försumbar) påverkar dessutom cellförlängning (7G, CCR = 3,61, försumbar).Viktigast av allt, SC-79 AKT-aktivatorn återställde den långsträckta fenotypen av SPECC1L-kd-celler (Fig. 7G, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Dessa resultat bekräftar att SPECC1L reglerar PI3K-AKT-signalering och tyder på att en måttlig minskning av SPECC1L påverkar cellvidhäftningen, medan en kraftig minskning leder till apoptos (Fig. 8).
(A–F') Kontrollceller (A, C, E) och SPECC1L-kd (B, D, F) behandlade med PI3K-AKT-väghämmare wortmannin (C, D) eller SC-79 aktivator (E, F) behandling Obehandlade kontrollceller är kubiska (A) med normal β-cat-cellulär färgning (A'), medan kd-celler är förlängda (B) med ökad β-cat-färgning (B').Efter undertryckande av PI3K-AKT-vägen förlängdes kontrollcellerna (C) med β-kattexpansion (C'), medan kd-celler började genomgå apoptos (D), liknande våra mycket muterade embryon och visade extremt förstärkt β-katt.färgning (D').Efter aktivering av PI3K-AKT-vägen förblev kontrollcellerna kuboidala (E) och hade normal β-cat (E') färgning, medan kd-celler visade signifikant förbättrad cellform (F) och β-cat (F') färgning, vilket indikerar (G) Graden av cellformsförändring i (AF) kvantifierades med användning av cellrundhetsförhållandet (CCR) för den längsta dimensionen (längd) och motsvarande vertikala dimension (bredd) med hjälp av MetaMorph-mjukvaran.Obehandlade (NT) SPECC1L-kd-celler (CCR = 3,46) var signifikant längre än kontrollceller (CCR = 1,56, p < 6,1 × 10–13).Worts hämning av PI3K-AKT-vägen i kontrollceller var tillräcklig för att orsaka en liknande förlängning i cellform (CCR=3,61, p<2,4×10-9).På liknande sätt återställde AKT-aktivering av SC-79 i SPECC1L-kd-celler cellförlängning till kontrollnivåer (CCR = 1,74, p <6,2 × 10–12).Wortmanninbehandling av SPECC1L-kd-celler resulterade i ökad apoptos men ingen ytterligare ökning av cellformsförändring (CCR=3,60) jämfört med obehandlade kd (CCR=3,46, ns) eller wortmanninbehandlade kontrollceller (3,61) observerade i .ns = spelar ingen roll.+/- SEM-mätningar för 50 celler visas.Statistiska skillnader beräknades med Students t-test.
(A) Schematisk representation av hämning och aktivering av PI3K-AKT-vägen vilket resulterar i AJ-förändringar respektive räddning.(B) Föreslagen modell för AKT-proteinstabilisering av SPECC1L.
Premigratoriska CNCC kräver AJ-lys för att separera från främre neurala veck neuroepitelceller1,15,32.Ökad färgning av AJ-komponenter och förlust av den apikala-basala AJ asymmetriska fördelningen i SPECC1L-bristceller både in vitro och in vivo, kombinerat med den fysiska närheten av SPECC1L till β-catenin, tyder på att SPECC1L fungerar för att korrekt upprätthålla AJ lokal stabilitet för organisationsmuskler.aktincytoskelett.Associationen av SPECC1L med aktincytoskelettet och β-catenin och ökningen av antalet kondenserade aktinfilament i frånvaro av SPECC1L överensstämmer med den observerade ökningen av AJ-densitet.En annan möjlighet är att ett ökat antal aktinfibrer i SPECC1L-bristceller leder till en förändring i intercellulär spänning.Eftersom cellulär stress påverkar AJ 33-dynamiken kan spänningsförändringar resultera i mer diffus AJ 34 .Så alla ändringar kommer att påverka CNCC-lagren.
Wnt1 uttrycks i de tidiga neurala vecken som ger upphov till neurala crestceller.Således markerar Wnt1-cre härstamningsspårning både före och migrerande NCC35.Men Wnt1 markerar också dorsala hjärnvävnadskloner som också härrör från tidiga neurala veck 35,36, vilket gör det troligt att vår färgning av E9.5-mutanter för Wnt1-markörer i öppna neurala veck inte är CNCC.Vår positiva färgning för NCC-markörerna AP2A och SOX10 bekräftade att de exponerade neurala vecken av Specc11-muterade embryon verkligen innehöll CNCC.Dessutom, eftersom AP2A och SOX10 är markörer för tidigt migrerande NCC, indikerade positiv färgning att dessa celler är postmigratoriska CNCC som inte kan stratifieras av E9.5.
Våra data tyder på att molekylär reglering av AJ av SPECC1L förmedlas av PI3K-AKT-signalering.AKT-signalering reduceras i SPECC1L-defekta celler och vävnader.Fynd av Fantauzzo et al.stödja en direkt roll för PI3K-AKT-signalering i kraniofacial morfogenes.(2014) visade att avsaknaden av aktivering av PDGFRα-baserad PI3K-AKT-signalering leder till en gomspaltfenotyp.Vi visar också att hämning av PI3K-AKT-vägen är tillräcklig för att ändra AJ och cellform i U2OS-celler.I överensstämmelse med våra fynd, Cain et al.37 visade att nedreglering av PI3K α110-subenheten i endotelceller resulterar i en liknande ökning av pericellulär β-cateninfärgning, hänvisad till som en ökning av "anslutningsindex".Men i endotelceller vars aktinfilament redan är mycket organiserade, resulterar suppression av PI3K-AKT-vägen i en lös cellform.Däremot visade SPECC1L-kd U2OS-celler en långsträckt cellform.Denna skillnad kan vara celltypsspecifik.Medan undertryckande av PI3K-AKT-signalering permanent påverkar aktincytoskelettet, bestäms effekten på cellformen av förändringar i spänning som orsakas av förändringar i densiteten och organisationen av centrala aktinfibrer.I U2OS-celler använde vi endast cellformsförändringar som en markör för SPECC1L-defekt AJ förändring och återhämtning.Sammanfattningsvis antar vi att hämning av AKT-vägen i SPECC1L-brist ökar AJ-stabiliteten och minskar delaminering i CNCC.
Intressant nog reducerades pan-AKT-nivåer in vitro och in vivo utöver fosforylerade 473-AKT-nivåer i frånvaro av SPECC1L, vilket tyder på reglering av PI3K-AKT-signalering på nivån av AKT-proteinstabilitet eller omsättning.SPECC1L- och MID1-generna, båda associerade med Opitz/GBBB-syndrom, kodar för proteiner som stabiliserar mikrotubuli 18,22.Mekanismen genom vilken SPECC1L och MID1 förmedlar mikrotubulistabilisering är inte helt klarlagd.När det gäller SPECC1L inkluderar denna stabilisering förbättrad acetylering av en undergrupp av mikrotubuli 18 .Det är möjligt att SPECC1L använder en liknande mekanism för att stabilisera andra proteiner som AKT.Det har visats att acetylering av lysinrester i AKT-proteinet leder till en minskning av membranlokalisering och fosforylering38.Dessutom krävs ubiquitination av K63-kedjan vid samma lysinrest på AKT för dess membranlokalisering och aktivering39,40.Bland flera faktorer som interagerar med SPECC1L-proteiner som identifierats i olika tvåhybridskärmar med hög genomströmning av jäst, har fyra – CCDC841, ECM2942, APC och UBE2I43 – varit inblandade i proteinomsättning eller stabilitet via ubiquitination eller sumoylering.SPECC1L kan vara involverad i posttranslationell modifiering av AKT-lysinrester, vilket påverkar AKT-stabiliteten.Den kritiska rollen för SPECC1L i lokaliseringen och stabiliteten av AKT-proteinet återstår dock att belysas.
Allvarliga defekter i SPECC1L-uttryck in vivo resulterade i ökad AJ-markörfärgning och defekt CNCC-överlagring, såväl som ökad apoptos och tidig embryonal dödlighet.Tidigare rapporter har visat att musmutanter med ökade nivåer av apoptos är associerade med neuralrörsdefekter 44,45,46,47 och kraniofaciala defekter48.Det har föreslagits att överdriven celldöd i neurala veck eller svalgbågar kan resultera i ett otillräckligt antal celler som krävs för korrekt morfogenetisk rörelse 48,49,50.Däremot visade våra SPECC1L-defekta cellinjer med måttligt reducerat SPECC1L-uttryck endast AJ-förändringar utan bevis för ökad celldöd.Kemisk hämning av PI3K-AKT-vägen i dessa Kd-celler resulterade dock i ökad apoptos.Således säkerställer en måttlig minskning av SPECC1L-uttryck eller funktion cellöverlevnad.Detta överensstämmer med observationen att sällsynta Specc11-muterade embryon som undkommer arrestering vid st.E9.5 - kanske på grund av minskad genfångningseffektivitet - kan stänga sina nervrör och stoppa senare i utvecklingen, ofta med kraniofaciala defekter (Fig. S3).Också överensstämmande med detta är den sällsynta förekomsten av heterozygota Specc1l-embryon med kraniofaciala abnormiteter – troligen på grund av ökad genfångningseffektivitet – samt upptäckten hos zebrafisk där en av de två SPECC1L-ortologerna (specc1lb) orsakar sena embryonala fenotyper, inklusive förlust av underkäkar och bilaterala klyftor51.Således kan heterozygota SPECC1L-funktionsförlustmutationer identifierade hos mänskliga patienter orsaka små försämringar av SPECC1L-funktionen under kraniofacial morfogenes, tillräckligt för att förklara deras orofaciala klyftor.SPECC1L-baserad reglering av intercellulära kontakter kan också spela en roll i palatogenes och sammansmältning av svalgbågarna.Ytterligare studier av SPECC1L-funktionen kommer att hjälpa till att belysa rollen av tillfälliga intercellulära kontakter i CNCC under stängning av neuralröret i neuroepitelcellernas motilitet och kraniofacial morfogenes.
U2OS osteosarkomkontroll och SPECC1L-kd-celler har beskrivits tidigare (Saadi et al., 2011).Antikroppar mot SPECC1L har också karakteriserats tidigare (Saadi et al., 2011).Anti-β-catenin antikroppar (kanin; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (mus; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), myosin IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Colo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornien), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA) ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), klyvd kaspas 3 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) och p-aktin (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) användes såsom beskrivits..Aktinfilament färgades med Acti-stain rhodamine phalloidin (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS-kontrollceller och SPECC1L-kd-celler odlades i standard högglukos-DMEM kompletterat med 10 % fetalt bovint serum (Life Technologies, Carlsbad, CA).För AJ-förändringar såddes 2 x 105 celler på glas behandlat med 0,1 % svingelatin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) och observerades med avseende på förändringar i cellform.Celler samlades in vid olika angivna tidpunkter: 4 timmar efter sådd (t = 1), 24 timmar efter sådd (t = 2), sammanflöde utan förändring i cellform (t = 3), förändring i cellform (t = 4) 24 timmar efter cellformförändring (t = 5) och 48 timmar efter cellformförändring (t = 6) (fig. 1, 2, 3).För att modulera PI3K-AKT-vägen odlades celler i de angivna koncentrationerna med PI3K-AKT-hämmaren wortmannin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) eller SC-79-aktivator (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Mediet som innehöll kemikalierna byttes dagligen.
Frame-by-frame-inspelningar gjordes på levande kontroll- och KD-celler under normala odlingsförhållanden, och faskontrastbilder samlades in var 10:e minut under 7 dagar.Bilder togs med hjälp av ett datorstyrt Leica DM IRB inverterat mikroskop utrustat med en mekanisk scen och ett 10 × N-PLAN objektiv kopplat till en QImaging Retiga-SRV-kamera.Under avbildning hölls cellkulturer vid 37°C i en fuktig atmosfär med 5% CO2.
Två genfälla ES-cellinjer DTM096 och RRH048 från Regional Mutant Mouse Resource Center (UC Davis, CA) användes för att generera Specc11-defekta muslinjer, betecknade SpeccllgtDTM096 och SpeccllgtRRH046.Kortfattat injicerades 129/REJ ES-celler i C57BL6-blastocyster.De resulterande chimära hanmössen uppföddes med honmöss C57BL6 för att identifiera avkommor med agouti-pälsfärgning.Närvaron av genfällvektorinsättningar användes för att identifiera heterozygoter.Möss hölls på en blandad bakgrund av 129/REJ;C57BL6.Placeringen av insättningsstället för den genetiska fällvektorn bekräftades genom RT-PCR, genomsekvensering och genetisk komplementering (kompletterande figur 1).För att spåra CNCC-härstamningen av dubbla heterozygota Specc1lGT-möss korsades ROSAmTmG (#007576) och Wnt1-Cre (#003829) möss (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) för att producera ROSAmTmG- och Wnt1-Cres1ol-allelen i Speccyl-embryol.Alla experiment på möss utfördes enligt protokoll som godkänts av Institutional Animal Care and Use Committee vid University of Kansas Medical Center.
Embryon fixerades i (1 % formaldehyd, 0,2 % glutaraldehyd, 2 mM MgCl2, 0,02 % NP-40, 5 mM EGTA) i 60 minuter vid rumstemperatur.Efter fixering i X-gal-färgningslösning (5 mM kaliumferricyanid, 5 mM kaliumferrocyanid, 2 mM MgCl2, 0,01 % natriumdeoxicholat, 0,02 % NP-40, 1 mg/ml X-gal) utfördes färgutveckling vid 37°C .°C inom 1-6 timmar.Embryon efterfixerades i 4% PFA och visualiserades.
För Western blotting lyserades celler i passiv lysbuffert (Promega, Fitchburg, WI) kompletterad med en blandning av HALT-proteashämmare (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lysater bearbetades på 12 % polyakrylamid Mini-PROTEAN TGX färdiga geler (Bio-Rad, Hercules, CA) och överfördes till Immobilon PVDF-membran (EMD Millipore, Billerica, MA).Membranen blockerades i 5 % mjölk i PBS innehållande 0,1 % Tween.Antikroppar inkuberades över natten vid 4°C eller under en timme vid rumstemperatur.Femto SuperSignal West ECL-reagens (Thermo Scientific, Waltham, MA) användes för signalgenerering.För immunfärgning fixerades embryon över natten i 4% PFA/PBS och kryokonserverades.Vävnadskryosektioner blockerades i PBS innehållande 1 % normalt getserum (Thermo Scientific, Waltham, MA) och 0,1 % Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) och inkuberades sedan vid 4°C i en inkubator under natt.med anti-antikropp och fluorescerande sekundär antikropp (1:1000) under 1 timme vid 4°C.Färgade sektioner placerades i ProLong guldmedium (Thermo Scientific, Waltham MA) och platta bilder erhölls med ett Leica TCS SPE konfokalmikroskop.Varje immunfärgning utfördes som tre oberoende experiment på tvärsnitt av minst två muterade embryon.Ett representativt experiment visas.
Celler inkuberades i modifierad RIPA-buffert (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 % NP-40, 130 mM NaCl, 10 % glycerol, 2 mM EDTA och HALT-proteashämmare (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) Kortfattat förrenades lysaten med protein G magnetiska pärlor (Life Technologies, Carlsbad, CA) och inkuberades sedan över natten vid 4°C. med anti-SPECC1L eller IgG protein G-proteinpärlor användes för att extrahera SPECC1L och Western blotting utfördes med anti-SPECC1L eller IgG protein. -β-catenin-antikropp beskriven ovan. Co-IP-experimenten som visas är representativa för fyra oberoende experiment.
Fixerade odlade celler eller embryonala musvävnader tillhandahölls elektronmikroskopicentret vid University of Kansas Medical Center.Kortfattat inbäddades prover i EMbed 812-harts (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), polymeriserades över natten vid 60°C och sektionerades vid 80 nm med användning av en Leica UC7 ultramikrotom utrustad med ett diamantblad.Sektioner visualiserades med användning av ett JEOL JEM-1400 transmissionselektronmikroskop utrustat med en 100 kV Lab6-pistol.
Hur man citerar den här artikeln: Wilson, NR et al.Brist på SPECC1L leder till ökad stabilitet hos skarvade leder och minskad delaminering av kraniala nervceller.vetenskapen.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Saint-Jeanne, J.-P.Induktion och differentiering av nervkammen.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Kranial neural crest celler i rörelse: deras roll i kraniofacial utveckling.American Journal of Medical Genetics.Del A 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurokristopati: dess tillväxt och utveckling under 20 år.Barnläkare.patologi.laboratorium.medicin.17, 1-25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU och Noten MM Genombrott i genetiken av orofaciala klyftor.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. och Riley, FM Molekylära mekanismer för migration och mönstring av kraniella nervceller under kraniofacial utveckling.Utveckling 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH och Murray, JK Läpp- och gomspalt: förstå genetiska och miljömässiga influenser.naturlig kommentar.Genetics 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Onormal morfogenes av hud, extremiteter och kraniofaciala regioner hos möss med brist på interferon-reglerande faktor-6 (Irf6).National Genette.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.Dominanta mutationer i GRHL3 orsakar van der Waords syndrom och försämrar utvecklingen av den orala peridermen.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ och Juriloff, DM Uppdatera listan över musmutanter med defekter i neuralrörsförslutning och framsteg mot en fullständig genetisk förståelse av neuralrörsförslutning.Utredning av fosterskador.Del A, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-medierad PDGFRalfa-signalering reglerar överlevnad och proliferation i skelettutveckling genom en p53-beroende intracellulär väg.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND och Murdoch, JN Disheveled: Relation av konvergent expansion till neuralrörsstängning.Trender inom neurologi.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).